Wytwarzanie rozszerzalnej matrycy mózgu, którą można dostosować na różne etapy rozwoju

Tworzenie rozszerzalnej matrycy mózgu dostosowalnej na różne etapy rozwojowe, autorstwa Chapmana i współpracowników z Uniwersytetu Kentucky w Lexington, Kentucky. Rozwój mózgu prosiaczka jest pod wieloma względami bardzo podobny do mózgu ludzkiego. W porównaniu do szczurów i myszy, stosunek masy mózgu prosiatka od urodzenia do dojrzałości jest znacznie bliższy ludzkiemu, a funkcjonalne obszary mózgów prosiatka i ludzkich są bardzo podobne.

Z tych powodów rośnie wykorzystanie świń i innych dużych ssaków w badaniach neurobiologicznych. Jednak komercyjne macierze mózgu dla większych ssaków są kosztowne, a wybór często ogranicza się do jednego rozmiaru lub płaszczyzny sekcji. W konsekwencji macierze komercyjne mogą nie być odpowiednie dla różnych szczepów, zarówno męskich, jak i żeńskich, oraz w różnym wieku.

Jest to szczególnie problematyczne w badaniach neurobiologii rozwojowej, w których rozmiary mózgu zmieniają się znacząco wraz ze wzrostem poporodowym. Na przykład mózgi prosiatek szybko rosną w ciągu pierwszych trzech miesięcy, zwiększając objętość ponad trzykrotnie. Komercyjna matryca mózgu prosiatka została zaprojektowana tak, aby pasować do mózgów prosto do dwóch tygodni życia.

Przedstawiamy tutaj metodę tworzenia matryc na akrylowej płytce jako opłacalne i łatwe do wdrożenia rozwiązanie tego problemu. Do tego eksperymentu pozyskano cztery naiwne, czterodniowe świnie. Jeden był wykorzystywany do pobierania mózgu w wieku pięciu dni, dwa w wieku 32 dni, a jeden w wieku 38 dni.

Po usunięciu mózgu z czaszki mózg był zanurzony w formacie 10% buforowanej formaliną przez dwa dni, a następnie umieszczany w roztworze 30% sacharozy przez pięć dni w celu zachowania kriogeni. Następnie przedstawimy, jak wykonać odlew mózgu za pomocą żelu agarozowego. Pierwszym krokiem do stworzenia matrycy jest stworzenie formy mózgu.

Zilustrujemy proces tworzenia formy mózgu prosiatka z piątego dnia porodu, który zostanie użyty do zbudowania matrycy strzałkowej. Umieść pasek wytrzymałego plastiku na dnie szklanego pojemnika, uważając, aby oba końce wystawały poza krawędzie pojemnika. Ten pasek ułatwi wydobycie bloku agarozy.

Zanurz pojemnik mniej więcej do połowy w wiadrze z mokrym lodem. W szklanej zlewce podgrzej 150 mililitrów PBS do 90 stopni Celsjusza i dodaj sześć gramów agarozy, mieszając cały czas. Powoli wlewaj roztwór 4% agarozy, aby uzyskać warstwę o grubości pół do jednego centymetra na dnie pojemnika i pozwól mu zastygnąć.

Całkowicie pokryj mózg cienką warstwą oleju mineralnego, aby zapobiec wiązaniu się agarozy z powierzchnią mózgu lub uwięzieniu się w bęzdach. Olej sprawia też, że usunięcie mózgu z żelu agarozowego jest znacznie łatwiejsze. Po powleknięciu umieść mózg na cienkiej warstwie agarozy w pożądanej orientacji, aby forma koronalna lub strzałkowa była jak najbardziej prosta i pionowa.

Pozwól roztworowi agarozy ostygnąć do 50 stopni Celsjusza, mieszając cały czas, aby zachować lepkość do wylewania. Następnie przelej roztwór agarozy na mózg, aż całkowicie się zakorzeni. Pozwól agarozie zastygnąć w temperaturze pokojowej.

Przetnij warstwę agarozy nad mózgiem sondą chirurgiczną, podążając za konturem mózgu. Gdy cięcie wokół mózgu jest zakończone, użyj cienkiej łopatki, aby delikatnie zdjąć wierzchnią warstwę agarozy. Uważaj, aby nie przeciąć ani nie naciąć mózgu podczas tych etapów.

Delikatnie wyjmij cały mózg z pleśni. Powinno się to dość łatwo wyjść dzięki olejowi mineralnemu nałożonemu wcześniej na powierzchnię. Upewnij się, że usuwasz wszelkie małe kawałki żelu agarozowego, które mogły wpadnąć do wycisku.

Podgrzej 98 mililitrów PBS w zlewce do 9 stopni Celsjusza i dodaj cztery gramy agarozy oraz dwa mililitry atramentu indyjskiego. Dobrze wymieszaj. Wlej ten roztwór agarozy do odciska pozostawionego przez mózg, uważając, by nie przelać odcisku.

Pozwól czarnemu żelowi zastygnąć. Trzymaj oba końce plastikowego paska i podnieś cały blok agarozy z pojemnika. Teraz pokażemy, jak stworzyć szablonowe płytki dla swojej macierzy.

Aby pokroić formę mózgową, umieść jeden kawałek papieru w skali między dwoma przezroczystymi akrylowymi płytkami o średnicy 76 mm i umieść je blisko krawędzi stołu. Następnie użyj zacisków, aby zabezpieczyć cztery narożniki i dwie akrylowe płytki, aby zbudować dwie ściany trzymające agarozowe bloki w pożądanej orientacji. Przednie krawędzie dwóch metalowych kwadratów narożnych oraz dwóch pionowych akrylowych płytek powinny być ustawione wzdłuż jednej strony papieru w skali.

Umieść blok żelu agarozowego tak, aby krawędź do cięcia była wyrównana z warstwą papieru skalowego oraz z krawędziami pionowych płyt akrylowych i kwadratów narożnych, a po przeciwnej stronie bloku agarozy umieść ciężarek, aby utrzymać go na miejscu. Przytnij nadmiar z bloku, aż odlew mózgu indyjskiego tuszu będzie prawie wycięty. Przesuwaj blok agarozy do przodu w pożądanych krokach, na przykład dwa lub pięć milimetrów za pomocą oznaczeń na papierze skalowym.

Chwyć ostrze mocno obiema rękami i prowadź go wzdłuż przednich krawędzi obu płyt akrylowych i narożników, aby przeciąć blok. Każdy kawałek umieść na drugiej kartce papieru w skali i mocno dociśnij, aby przenieść odcisk na papier. Długopisem zarysuj cały fragment.

Usuń plaster i wyrysuj kontur mózgu wyznaczony przez tusz Indii. Zwróć uwagę na orientację pierwszego kawałka na papierze skalowym, na przykład tylną i przednią dla przekrojów strzałkowych, i zachowaj jej spójność przy dodawaniu kolejnych plasterków żelu na papier w trakcie procesu. Numeracja każdego odrysowania kolejno.

Wytnij akrylowe płytki na 10 na 8,5 centymetra. Następnie ułóż je w stos i przymocuj do stołu wiertarki za pomocą kwadratów narożnych i zacisków. Wywierć trzy otwory w stosie z współrzędnymi wskazanymi w rękopisie.

Usuń folię ochronną z akrylowych płytek. Następnie umieść płytkę akrylową nad szablonem na papierze w skali i wyrównaj górne linie płyty akrylowej z górnymi krawędziami szablonu. Narysuj kontur mózgu na akrylowej płycie markerem permanentnym.

Oznacz każdą tabliczkę tak, aby odpowiadała numerowi szablonu lub śledzenia mózgu. Za pomocą piły taśmowej wytnij każdą blachę wzdłuż skopiowanych linii szablonu. Alternatywnie można użyć narzędzia obrotowego z końcówką do rzeźbienia drewna, aby usunąć niepożądane obszary.

Poleruj krawędź tnącą narzędziem obrotowym z końcówką szlifierką, aby wygładzić krawędzie, ponieważ ostre krawędzie mogą uszkodzić mózg podczas krojeń. Sprawdź dokładność cięcia, nakładając akrylową płytkę na szablon. Wytnij i poleruj w razie potrzeby.

Następnie zilustrujemy montaż płyt. Złóż macierz wstępnie, układając płytki w kolejności kolejnej i sprawdzając ich wyrównanie. Montaż matrycy zaczyna się od włożenia trzech długich śrub ze stali nierdzewnej przez pierwszą płytę akrylową, a następnie założenia podkładki na każdej śrubie.

Umieść drugą płytkę i dodaj podkładki do każdej śruby. Alternatywnie, podkładki można przykleić wokół otworów kotwiących superklejem, aby uniknąć konieczności dodawania podkładek osobno przy każdym montażu. Powtarzaj ten proces, aż wszystkie płyty zostaną kolejno dodane do śrub.

Dokręć wszystko razem nakrętką na każdej śrubie. Wykonaj ostateczne polerowanie krawędzi skierowanych do mózgu, aby przejść płynniej z płyty na płytę. Używaj markerów w różnych kolorach, aby pokolorować górną krawędź akrylowych płyt na przemian kolorami, co ułatwi cięcie.

Tutaj na przemian wybieraliśmy tablice czarne, czerwone i nieoznaczone. Na koniec zademonstrujemy proces przecięcia mózgu zarówno w płaszczyźnie koronalnej, jak i strzałkowej. Aby przeciąć mózg, umieść go w matrycy w tej samej orientacji, w jakiej był podczas formowania i jak najbardziej prosto.

Do cięcia mózgu będziesz potrzebować szerokiego, płaskiego ostrza. Szerokie ostrze ogranicza ryzyko skręcania lub wygięcia podczas cięcia. Zalecamy wysokoprofilowy kriostat.

Dla bezpieczeństwa owiń jeden koniec ostrza o długości około dwóch centymetrów taśmą laboratoryjną, aby stworzyć miejsce do bezpiecznego trzymania owiniętego końca podczas cięcia mózgu. Uwaga ostrożności. Ponieważ każda część mózgu ma inną strukturę po utrwaleniu formaliny, należy zachować ostrożność, aby równomiernie naciskać ostrze.

Co więcej, mózg prosiatka jest duży, więc lepiej używać ruchu cięcia do cięcia niż bezpośredniego, dociskającego do dołu. Ostrze powinno być ciągnięte z nieprzerwaną siłą z jednej strony na drugą, upewniając się, że sięga wystarczająco głęboko, by przeciąć cały mózg. Wszystkie plasterki przełóż do sześcioosobowej tacy lub stalowej tacy wypełnionej PBS.

Ostrożnie układaj plasterki na tacy, zachowując kolejność i orientację plasterków, a następnie konserwuj lub kontynuuj w razie potrzeby. Aby dostosować geometrię lub powiększyć komorę dla lepszego dopasowania do mózgu, można usunąć lub dodać wybrane akrylowe płytki, aby dostosować matrycę do różnych rozmiarów mózgu. Tutaj ilustrujemy rozszerzenie macierzy strzałkowej zbudowanej dla mózgu prosięta P5, dodając kilka płytek, tutaj na niebiesko i zielono, do środkowej części matrycy.

Matryca ta nadaje się teraz do przekroju strzałkowego prosięta P38. Możliwość powiększania lub zmniejszania rozmiaru matrycy znacznie zwiększa jej elastyczność i pozwala zaoszczędzić zarówno materiały, jak i wysiłek. Podobnie jak przy cięciu koronalnym, ostrożnie przeciąć mózg w płaszczyźnie strzałkowej, używając kolejnych płytek do prowadzenia ostrza.

System kodowania kolorów pomaga określić prawidłowe kolejne ułożenie ostrza, co jest trudne, gdy cięcia są cienkie. Wyjmij mózg z matrycy i delikatnie rozdziel plasterki. Podsumowując, opracowaliśmy łatwą, przystępną kosztowo i elastyczną metodę tworzenia macierzy mózgowych dla noworodkowych prosiętek.

Koncepcja ta może być stosowana do starszych świń oraz innych modeli dużych zwierząt.