Name: Powtarzalny 3D test migracji glejaka z magnetyczną lokalizacją sferoidów za pośrednictwem nanocząstek magnetycznych w warunkach hipoksycznych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-05-12T13:10:00.000+00:00
Duration: 7 min 55 s
Description: Poznaj powtarzalny test migracji 3D glejaka z lokalizacją magnetyczną sferoidów w warunkach hipoksycznych. Ta metoda umożliwia badanie zachowań migracyjnych i inwazyjnych potencjału nowotworów pochodzących od pacjentów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Prace te były wspierane przez Research Ireland (Science Foundation Ireland) na podstawie kodu grantowego 20391A01 oraz Health Research Board na podstawie kodu grantowego ERA-TRANSCAN-2022-002. Komórki zostały uprzejmie udostępnione przez naszych współpracowników z laboratorium Dirksa, SickKids w Toronto oraz Erasmus Medical Center (EMC) w Rotterdamie.

<ol><li>Singh, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glioblastoma+at+the+crossroads%3A+Current+understanding+and+future+therapeutic+horizons%5BTitle%5D)+AND+%22Signal+Transduct+Target+Ther%22%5BJournal%5D)">Glioblastoma at the crossroads: Current understanding and future therapeutic horizons.</a> Signal Transduct Target Ther. 10 (1), 213(2025).</li>
<li>Spitzer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deciphering+the+longitudinal+trajectories+of+glioblastoma+ecosystems+by+integrative+single-cell+genomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Deciphering the longitudinal trajectories of glioblastoma ecosystems by integrative single-cell genomics.</a> Nat Genet. 57 (5), 1168-1178 (2025).</li>
<li>Dirkse, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell-associated+heterogeneity+in+glioblastoma+results+from+intrinsic+tumor+plasticity+shaped+by+the+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Stem cell-associated heterogeneity in glioblastoma results from intrinsic tumor plasticity shaped by the microenvironment.</a> Nat Commun. 10 (1), 1787(2019).</li>
<li>Dejaegher, J., De Vleeschouwer, S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDejaegher%2C+J+%22Glioblastoma%22">Glioblastoma</a>. De Vleeschouwer, S. , Brisbane (AU). (2017).</li>
<li>Restall, I., Bozek, D. A., Chesnelong, C., Weiss, S., Luchman, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live-cell+imaging+assays+to+study+glioblastoma+brain+tumor+stem+cell+migration+and+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Live-cell imaging assays to study glioblastoma brain tumor stem cell migration and invasion.</a> J Vis Exp. (138), e58152(2018).</li>
<li>Xie, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+human+glioblastoma+cell+culture+resource%3A+Validated+cell+models+representing+all+molecular+subtypes%5BTitle%5D)+AND+%22EBioMedicine%22%5BJournal%5D)">The human glioblastoma cell culture resource: Validated cell models representing all molecular subtypes.</a> EBioMedicine. 2 (10), 1351-1363 (2015).</li>
<li>Paolillo, M., Comincini, S., Schinelli, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+glioblastoma+models%3A+A+journey+into+the+third+dimension%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">In vitro glioblastoma models: A journey into the third dimension.</a> Cancers (Basel). 13 (10), 2449(2021).</li>
<li>Aye, K. T. N., Ferreira, J. N., Chaweewannakorn, C., Souza, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+the+application+of+iron+oxide+nanoparticles+%28ions+and+spions%29+in+three-dimensional+cell+culture+systems%5BTitle%5D)+AND+%22SLAS+Technol%22%5BJournal%5D)">Advances in the application of iron oxide nanoparticles (ions and spions) in three-dimensional cell culture systems.</a> SLAS Technol. 29 (3), 100132(2024).</li>
<li>Das, V., Furst, T., Gurska, S., Dzubak, P., Hajduch, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reproducibility+of+uniform+spheroid+formation+in+384-well+plates%3A+The+effect+of+medium+evaporation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomol+Screen%22%5BJournal%5D)">Reproducibility of uniform spheroid formation in 384-well plates: The effect of medium evaporation.</a> J Biomol Screen. 21 (9), 923-930 (2016).</li>
<li>Das, V., Furst, T., Gurska, S., Dzubak, P., Hajduch, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaporation-reducing+culture+condition+increases+the+reproducibility+of+multicellular+spheroid+formation+in+microtiter+plates%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Evaporation-reducing culture condition increases the reproducibility of multicellular spheroid formation in microtiter plates.</a> J Vis Exp. (121), e55403(2017).</li>
<li>Mansoury, M., Hamed, M., Karmustaji, R., Al Hannan, F., Safrany, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+edge+effect%3A+A+global+problem.+The+trouble+with+culturing+cells+in+96-well+plates%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Rep%22%5BJournal%5D)">The edge effect: A global problem. The trouble with culturing cells in 96-well plates.</a> Biochem Biophys Rep. 26, 100987(2021).</li>
<li>Zanoni, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3d+tumor+spheroid+models+for+in+vitro+therapeutic+screening%3A+A+systematic+approach+to+enhance+the+biological+relevance+of+data+obtained%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">3d tumor spheroid models for in vitro therapeutic screening: A systematic approach to enhance the biological relevance of data obtained.</a> Sci Rep. 6, 19103(2016).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+An+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: An open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Arganda-Carreras, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trainable+weka+segmentation%3A+A+machine+learning+tool+for+microscopy+pixel+classification%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Trainable weka segmentation: A machine learning tool for microscopy pixel classification.</a> Bioinformatics. 33 (15), 2424-2426 (2017).</li>
<li>Sayde, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reproducible+3d+culture+of+multicellular+tumor+spheroids+in+supramolecular+hydrogel+from+cancer+stem+cells+sorted+by+sedimentation+field-flow+fractionation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chromatogr+A%22%5BJournal%5D)">Reproducible 3d culture of multicellular tumor spheroids in supramolecular hydrogel from cancer stem cells sorted by sedimentation field-flow fractionation.</a> J Chromatogr A. 1736, 465393(2024).</li>
<li>Lee, S., Lim, J., Kwak, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+of+bias+in+spheroid-based+drug+screening%3A+Fabrication+method%2C+spheroid+size%2C+and+cell+viability%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Pharmacother%22%5BJournal%5D)">Factors of bias in spheroid-based drug screening: Fabrication method, spheroid size, and cell viability.</a> Biomed Pharmacother. 192, 118597(2025).</li>
<li>Aisenbrey, E. A., Murphy, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+alternatives+to+matrigel%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mater%22%5BJournal%5D)">Synthetic alternatives to matrigel.</a> Nat Rev Mater. 5 (7), 539-551 (2020).</li>
<li>Barbugian, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioresponsive+hyaluronic+acid-based+hydrogel+inhibits+matrix+metalloproteinase-2+in+glioblastoma+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22ChemMedChem%22%5BJournal%5D)">Bioresponsive hyaluronic acid-based hydrogel inhibits matrix metalloproteinase-2 in glioblastoma microenvironment.</a> ChemMedChem. 20 (15), e202401040(2025).</li>
<li>Carvalho, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viscoelastic+high-molecular-weight+hyaluronic+acid+hydrogels+support+rapid+glioblastoma+cell+invasion+with+leader-follower+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Mater%22%5BJournal%5D)">Viscoelastic high-molecular-weight hyaluronic acid hydrogels support rapid glioblastoma cell invasion with leader-follower dynamics.</a> Adv Mater. 36 (50), e2404885(2024).</li>
</ol>

Nie ma nic do ujawnienia

Modelowanie inwazyjnej dynamiki wysoce agresywnych guzów, takich jak glejak, jest kluczowe dla lepszego zrozumienia procesów chorobowych i identyfikacji skuteczniejszych strategii leczenia. Złożony, adaptacyjny i plastyczny charakter migracji komórek glejaka wymaga modeli przedklinicznych, które potrafią dokładnie uchwycić dynamiczne zachowania poszczególnych komórek glejaka podczas migracji z masy guza centralnego. Co ważne, modelowanie tych procesów na próbkach pochodzących od pacjentów z różnych stadiów choroby pozwala naukowcom lepiej radzić sobie z problemem heterogeniczności guzów oraz identyfikować wszelkie zmiany w dynamice inwazji specyficznych dla określonych stadiów.
Biorąc pod uwagę tę złożoność, rozsądnie jest założyć, że modele przedkliniczne powinny posiadać równy poziom zaawansowania. Tutaj opisujemy udoskonaloną metodę generowania jednolicie wielkości glejowaków pochodzących od pacjenta, współhodowanych z nanocząstkami tlenku żelaza. Takie podejście umożliwia kontrolowaną lokalizację glejowaków w centrum każdego dołu, umożliwiając automatyczne obrazowanie dynamiki inwazji na żywych komórkach. Kilka badań podkreśliło istotną zmienność rozmiaru, kształtu i kinetyki wzrostu sferoidów przy użyciu konwencjonalnych metod hodowli 3D. Sayde i współpracownicy wykazali, że sferoidy mogą wykazywać szerokie rozkłady średnic między tymi pochodzącymi z populacji komórek macierzystych niesortowanych a sortowanymi, co odzwierciedla wrodzoną zmienność w formowaniu sferoidów15,16. Ta heterogeniczność została również zidentyfikowana jako główne źródło problemów z powtarzalnością w testach przesiewowych na obecność leków opartych na sferoidach, co dodatkowo podkreśla znaczenie generowania jednorodnych populacji sferoidów12. Wyniki te podkreślają konieczność standaryzacji warunków formowania się sferoidów przed przeprowadzeniem analiz funkcjonalnych, co jest wyzwaniami, które ta metoda bezpośrednio rozwiązuje. Poprzez standaryzację zarówno rozmiaru i położenia sferoidów, metoda ta znacząco zwiększa powtarzalność i minimalizuje zmienność typową dla systemów hodowli komórek 3D, gdzie nierównomierne tworzenie sferoidów może wpływać na dalszą analizę.
Podczas początkowego opracowania tego testu zaobserwowaliśmy znaczną zmienność lokalizacji sferoidów pomiędzy replikacjami, wymagającą użycia dużej liczby studni na eksperyment, ale także wielu biologicznych replikacji, aby uzyskać statystycznie istotne wyniki. To nie tylko znacznie zwiększyło obciążenie pracą, ale także generowało znaczną ilość nieużytecznych danych, zmniejszało efektywność testów i powtarzalność. Powstała zmienność odzwierciedlała więc utratę danych mierzalnych, a nie różnice w zachowaniu inwazyjnym. Centralizując gliomasphere w każdej studni, lokalizacja magnetyczna zapewnia, że obrazy ze wszystkich replik mogą być konsekwentnie segmentowane i analizowane, nawet tam, gdzie obserwuje się różnice biologiczne w dynamice inwazji między próbkami.
Wprowadzenie nanocząstek tlenku żelaza wprowadza delikatną siłę magnetyczną, która konsekwentnie centralizuje gliomasphere we wszystkich studniach, znacznie poprawiając wydajność pipeline'u przetwarzania obrazów, przetwarzania danych oraz analiz po migracji, nie wpływając przy tym na biologię gliomasphere ani żywotność8. Kluczową zaletą tego systemu jest jego kompatybilność z analizą multipleksacji po migracji; na przykład Rysunek 6 przedstawia analizę wizualizacji markera komórek macierzystych glejaka CD44, co umożliwia ocenę ekspresji komórek macierzystych podobnych po migracji i leczeniu między próbkami pacjentów. Ta zdolność podkreśla potencjał platform dla badań integracyjnych łączących fenotypy inwazyjne z cechami molekularnymi, co jest istotne ze względu na fenotypową plastyczność komórek macierzystych przypominających glejaka w odpowiedzi na sygnały mikrośrodowiskowe oraz ich zdolność do unikania leczenia, co sprzyja nieuchronnemu nawrotowi guza.
Chociaż ten test znacznie poprawia powtarzalność wizualizacji dynamiki inwazji pojedynczych sferoidów, istnieją pewne kluczowe ograniczenia, które należy wziąć pod uwagę przy przyszłej optymalizacji testu. Matrigel jest szeroko stosowanym modelem błony podstawnej, jednak jest złożonym, nieokreślonym substytutem macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) pochodzącym z mięśniaków myszy, który nie oddaje w pełni mikrośrodowiska ludzkiego mózgu17. Przyszła optymalizacja testu może uwzględnić specyficzne dla mózgu modele ECM, aby lepiej naśladować mikrośrodowisko guza mózgu, co uważamy za kluczowy krok optymalizacji modeli inwazji mózgu in vitro18,19. Chociaż Matrigel pozostaje szeroko stosowanym modelem ECM, reprezentuje niespecyficzną dla mózgu macierz zewnątrzkomórkową, pochodzącą z mięsaka mysiego. W związku z tym nie oddaje w pełni biochemicznych i mechanicznych właściwości mikrośrodowiska ludzkiego mózgu. Co ważne, opisana tutaj strategia lokalizacji magnetycznej jest niezależna od macierzy i może być łatwo adaptowana do specyficznych dla mózgu systemów ECM w przyszłych badaniach, aby dodatkowo zwiększyć istotność fizjologiczną.
Inne kwestie testu to potencjalne wymagania dotyczące trenowania nowego modelu segmentacji WEKA dla każdej linii komórkowej ze względu na heterogeniczność próbki oraz zmienność morfologii inwazji. Dodatkowo, zarówno gęstość zasiew, jak i stężenie nanocząsteczek powinny być zoptymalizowane dla każdej linii komórkowej i typu sferoidy, aby zachować jednolitość i żywotność przed przeprowadzeniem testów migracji o wysokiej przepustowości. Niezależnie od tych ograniczeń, platforma ta zapewnia skalowalne i elastyczne ramy do badania specyficznej inwazji glejaka i reakcji na leczenie. Jego kompatybilność z obrazowaniem żywych komórek, zautomatyzowanymi potokami segmentacyjnymi oraz multipleksowaną analizą po testach otwiera możliwości do badań przesiewowych o wysokiej treści nowych terapii, terapii skojarzonych oraz mechanistycznych badań inwazji z wysoce zróżnicowanych próbek guzów pacjentów. Ponadto, rozszerzenie tego testu na systemy kohodowlane, takie jak komórki mózgowe rezydentów, takie jak astrocyty, neurony i mikrogleje, czy modele interakcji bariery krew-mózg, dostarcza dodatkowych informacji na temat interakcji z gróżdżkami nowotworowymi, które napędzają postęp i nawrót glejaka mózgowego.
Podczas opracowywania testu zidentyfikowano kilka kroków technicznych jako kluczowe determinanty powtarzalności i ogólnej wydajności testu. Standaryzacja gęstości zasiewów linii komórkowych przed testem zapewnia spójność początkowego rozmiaru glejowaku, co umożliwia porównywalność dynamiki wzrostu sferoidów między liniami komórkowymi, leczeniem i warunkami. Bez tego etapu standaryzacji początkowe rozmiary sferoidów dodają znaczący poziom zmienności, który może odzwierciedlać zmienne reakcje glejaków na warunki eksperymentalne. Precyzyjna centralna lokalizacja glejaków w każdej studni jest kluczowym wymogiem dla precyzyjnego, automatycznego akwizycji obrazu i segmentacji w dalszej fazie. Nieobecne sferoidy powodowały znaczny szum obrazujący i uniemożliwiały wykorzystanie segmentacji WEKA jako sposobu segmentacji obrazów na wyraźnie określone obszary. Dzięki zapewnieniu, że wszystkie gliomafery są zlokalizowane w centrum, ten sam klasyfikator WEKA może być używany wielokrotnie, ponieważ szum jest znacznie osłabiony, a jakość obrazu dramatycznie się poprawia. Przedstawienie tego pokazano na rysunku 1. Wprowadzenie magnetycznych nanocząstek tlenku żelaza jest zatem metodą zapewnienia centralnego położenia gliomafer, minimalizując zmienność pozycji oraz znacząco poprawiając przetwarzanie obrazów i porównywalność między replikacjami. Na koniec, trening modelu segmentacji w ramach pipeline'u WEKA stanowi dodatkowy kluczowy krok standaryzacyjny. Ze względu na heterogeniczność między pacjentami oraz różnice w morfologii inwazji, pojedynczy model segmentacji może nie uogólniać się na wszystkie próbki. Przeszkolenie lub doprecyzowanie parametrów klasyfikacji dla każdej linii komórkowej zapewnia dokładne mapy prawdopodobieństwa obszarów inwazyjnych i zapobiega błędom ilościfikacyjnym.
Ogólnie rzecz biorąc, ten test stanowi powtarzalną i skalowalną platformę do badania dynamicznych, inwazyjnych zachowań próbek glejaka pochodzących od pacjentów w czasie rzeczywistym. Jego kompatybilność z multipleksowanym obrazowaniem oraz analizami molekularnymi w dalszej fazie czyni ją potężnym i wszechstronnym narzędziem zarówno do badań podstawowych, jak i translacyjnych glejaków, co znacznie zwiększy znaczenie translacyjne modeli glejaka przedklinicznego.

Glejak pozostaje jednym z najważniejszych wyzwań w onkologii neurochirurgicznej. Choroba ta jest napędzana przez rozległą heterogeniczność między i wewnątrz pacjenta, silne unikanie odpowiedzi na standardy opieki, odporność na indukcję apoptotyczną oraz niezwykłą plastyczność w odpowiedzi na warunki środowiskowe1. W ostatnich latach złożoność mikrośrodowiska nowotworowego (TME) zyskała znaczną uwagę, szczególnie dynamiczny charakter komórek macierzystych podobnych do glejaka (GSC), które mogą zmieniać fenotyp i stan komórkowy w odpowiedzi na zmiany mikrośrodowiskowe 2,3. Ta fenotypowa plastyczność sprzyja postępowi guza i przyczynia się do nieuniknionego nawrotu mimo agresywnego, standardowego leczenia na pierwszej linii. Resekcja chirurgiczna pozostaje najskuteczniejszą interwencją poprawiającą rokowanie pacjenta, jednak ze względu na wysoce infiltracyjny i mikroskopijny charakter glejaka blastasta, całkowite usunięcie guza nie jest możliwedo osiągnięcia 4. Modelowanie inwazyjnej dynamiki próbek pacjentów w różnych stadiach choroby oraz w specyficznych stanach guzowych ułatwi głębsze zrozumienie dynamicznej i plastycznej zdolności migracji glejaka i tym samym pomoże zidentyfikować skuteczne, nowatorskie podejścia terapeutyczne5. Dlatego opracowanie fizjologicznie istotnych modeli, które uwzględniają specyficzną dla pacjenta dynamikę inwazji i migracji, jest niezbędne dla rozwoju badań przedklinicznych i realizacji tych celów. Ponadto takie modele są kluczowe dla oceny skuteczności nowych terapii przeciwnowotworowych, które teoretycznie mogłyby być opracowane do stosowania w połączeniu z operacją, aby zapobiec resztkowej inwazji mikroskopowej i ostatecznie zmniejszyć ryzyko nawrotu. Złożoność glejaka usprawiedliwia potrzebę zaawansowanych, złożonych modeli przedklinicznych, które mogą odtworzyć kluczowe cechy architektoniczne guza. Modele trójwymiarowe pochodzące od pacjentów zyskały większą uwagę ze względu na zdolność do zachowania interakcji między komórkami, utrzymania gradientów składników odżywczych, tlenu i środków terapeutycznych oraz replikowania integralności strukturalnej rodzimych guzów 6,7. Jednak wizualizacja tych modeli 3D wiąże się z wyzwaniami technicznymi, w tym pozycjonowaniem sferoidów, zmiennością obrazowania oraz powtarzalnością testów.
Tutaj opisujemy specyficzny dla pacjenta model migracji glejaka 3D wykonany w warunkach hipoksycznych, umożliwiający badanie dynamiki migracyjnej w próbkach pochodzących z różnych podtypów i stadij chorobowych pacjentów, w tym próbek guzów nieleczonych i nawracających nowotworów. Platforma ta umożliwia ocenę różnicowych odpowiedzi na czynniki terapeutyczne i wspiera multipleksową analizę po migracji poprzez segmentację obrazów, umożliwiając ilościową ocenę dynamiki migracji, wzrostu sferoidów i ekspresji białek. Wprowadzenie magnetycznych nanocząstek tlenku żelaza pozwala na spójną centralizację sferoidów w każdej studni poprzez zastosowanie delikatnej siły magnetycznej8. Sferoidy hodowane na standardowych płytach wielodołowych często wykazują tendencję do dryfowania w kierunku krawędzi odwiertów, co uważa się za wpływ tworzenia łąkotki cieczy i odparowywania obwodowego, zwłaszcza w odwiertach na obwodzie płyty 9,10,11. Zjawiska te wprowadzają artefakty obrazowe i szum tła, szczególnie podczas mikroskopii światła transmisyjnego, co może utrudniać obrazowanie poklatkowe dynamiki inwazji. W przeciwieństwie do dwuwymiarowych hodowli monowarstwowych, gdzie do obrazowania można wybrać obszary o jednolitej gęstości komórek, testy inwazji pojedynczej sferoidy wymagają precyzyjnego i spójnego umiejscowienia całego obszaru sferoidalnego i migracyjnego w polu obrazowania. To stanowi dodatkowe wyzwanie, ponieważ dryf lub nieregularne położenie w odwiercie może obniżyć jakość danych i powtarzalność. Dlatego konsekwentne centralizowanie sferoidów w płytach wielodołkowych minimalizuje te wyzwania i poprawia nie tylko jakość obrazowania, ale także spójność eksperymentów, procesy przetwarzania obrazów oraz analizy po migracji. Dodatkowo, inicjowanie hodowli sferoidów przy jednolitej gęstości komórek w tych wyspecjalizowanych płytach sferoidalnych sprzyja powtarzalnemu powstawaniu sferoidów, zmniejszając zmienność morfologii, tempa wzrostu i integralności strukturalnej10,11. W praktyce typowe glejosfery używane w tych testach mają średnicę od 150 do 300 μm, formując się powtarzalnie przy ustandaryzowanych gęstościach komórek. Posiewy są utrzymywane w warunkach hipoksycznych (1%–2%O2).
Opisana tutaj platforma obsługuje formaty o umiarkowanej do wysokiej przepustowości, takie jak płytki 96-dołkowe, umożliwiające wielokrotne replikacje na próbkę pacjenta, i jest skalowalna do badań przesiewowych leków lub testów wieloschorzeniowych12 . Optymalizacja pozycji sferoidów i warunków hodowli jest zatem niezbędna dla zwiększenia odporności i znaczenia klinicznego 3D modeli przedklinicznych wykorzystywanych do badania potencjału inwazyjnego glejaka oraz innych dynamicznych procesów komórkowych.

<table><tbody><tr><td>ZESTAW BIODRUKUJĄCY 96 DOŁKÓW, PRZEZROCZYSTY</td><td>Greiner</td><td>655840</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Invitrogen</td><td>00-4555-56</td><td>Nie ma</td></tr><tr><td>Suplement B-27 (50X), surowica i suplement; wolne bez witaminy A</td><td>Gibco</td><td>12587010</td><td>10%</td></tr><tr><td>Podstawowy czynnik wzrostu fibroblastów, człowiek&nbsp; (bFGF)</td><td>PeproTech</td><td>100-18B</td><td>20&nbsp; ng/ml</td></tr><tr><td>Celldiscoverer&nbsp; 7</td><td>Zeiss</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Mikropłyty sferoidalne Corninga</td><td>Corning</td><td>CLS4515</td><td></td></tr><tr><td>Macierz Corninga Matrigela</td><td>Corning</td><td>354234</td><td>Ostateczne rozcieńczenie 1:100</td></tr><tr><td>Countess Automatyczny Licznik Komórek</td><td>Invitrogen</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>DMEM-F12&nbsp; (500ml)</td><td>Thermofischer</td><td>11320-074</td><td>Nie ma</td></tr><tr><td>Czynnik wzrostu naskórka ludzki (EGF)</td><td>PeproTech</td><td>AF-100-15</td><td>20&nbsp; ng/ml</td></tr><tr><td>FITC Mysz anty-ludzki CD44</td><td>BD Pharmingen</td><td>555478</td><td>1:100</td></tr><tr><td>Greiner CELLSTAR 96-dołkowa mikropłyta do hodowli polistyrenowych z F-dnem/kominową studnią i mikro; Przezroczysty,, TC, sterylny, z pokrywką</td><td>Greiner</td><td>655090</td><td></td></tr><tr><td>Heparyna</td><td>Thermofischer</td><td>A16198</td><td>5&mikro; g/ml</td></tr><tr><td>Hoechst 33258</td><td>&nbsp; Sigma Aldrich (Merck)</td><td>861405</td><td>1&mikro; g/ml</td></tr><tr><td>NanoShuttle-PL</td><td>Greiner</td><td>657841</td><td>1,5&nbsp; &mikro; L/10 000 komórek</td></tr><tr><td>Penicylina - Streptomycyna</td><td>Merck</td><td>P4333</td><td>1%</td></tr></tbody></table>

powtarzalny 3d test migracji glejaka z magnetyczną lokalizacją sferoidów za pośrednictwem nanocząstek magnetycznych w warunkach hipoksycznych

Reproducible 3D Glioblastoma Migration Assay with Magnetic Nanoparticle Mediated Spheroid Localization Under Hypoxic Conditions

Opisujemy powtarzalny 3D test migracji, mający na celu modelowanie migracyjnego i inwazyjnego potencjału glejaka glejaka pochodzącego od pacjenta z nowo zdiagnozowanych i nawracających guzów w klinicznie istotnych warunkach hipoksycznych. Gliomasphere o jednolitej wielkości są przenoszone na cienką warstwę macierzy zewnątrzkomórkowej i współhodowane z magnetycznymi nanocząstkami tlenku żelaza, co umożliwia ich centralną lokalizację w studniach hodowlanych poprzez umieszczenie na osłonie magnetycznej. Zastosowanie magnetycznych nanocząstek tlenku żelaza do zasiewów ułatwia precyzyjne, lokalizowane obrazowanie pojedynczych glejowaków pochodzących od pacjenta za pomocą delikatnej siły magnetycznej oraz optymalizuje zautomatyzowane procesy przetwarzania obrazów poprzez redukcję zmienności pozycji. Test ten wspiera szczegółowe badania zachowań migracyjnych glejaka w fizjologicznie istotnym mikrośrodowisku oraz umożliwia bezpośrednie porównanie potencjału inwazyjnego i zachowań migracyjnych między nowo zdiagnozowanymi a nawracającymi glejakami pochodzącymi od pacjenta. Metoda ta jest kompatybilna z obrazowaniem żywych komórek oraz analizą multipleksowaną, oferując skalowalną platformę do przedklinicznych badań migracji glejaka blaskowego, potencjału inwazyjnego oraz odpowiedzi terapeutycznej.

Korzystając z opisanego testu 3D migracyjnego w warunkach hipoksycznych, glejowaki z guzów nawracających pacjentów były leczone pojazdem lub lekiem X, a dynamika inwazji monitorowano co godzinę przez 72 godziny. Rysunek 5 opisuje analizę segmentacji WEKA dynamiki inwazji, ujawniając, że lek X znacząco zmniejsza potencjał inwazyjny nawracających gliomafer w porównaniu z kontrolą pojazdu w klinicznie istotnych warunkach hipoksycznych.
Aby dalej ocenić wpływ Leku X na cechy komórek macierzystych po migracji, glejaki zostały zdefiniowane i immunobarwione pod kątem ekspresji i lokalizacji markera komórek macierzystych glejaka CD44, jak pokazano na Rysunku 6. Ta analiza multipleksowana ułatwia wizualizację dynamiki migracji i ekspresji markerów komórek macierzystych, dostarczając wglądu w to, jak Lek X moduluje zarówno potencjał inwazyjny, jak i właściwości macierzyste modeli glejaka nawracającego w warunkach klinicznie istotnych w warunkach hipoksyjnych.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/70365/70365fig5.jpg" /> 
Rysunek 5: Zoptymalizowany test migracji podkreśla skuteczność nowego Leku X w zapobieganiu nawracającej migracji gliomasphere. Gleiaki pobierane przez pacjenta były leczone vehicle'em lub lekiem X przez 72 godziny w warunkach hipoksycznych. Dynamika inwazji była rejestrowana co godzinę przez 72 godziny. (A) Reprezentatywne obrazy światła transmitowanego na 0 godzin i 72 godzin w górnym panelu - Pojazd leczony i dolny panel - Lek X leczony. (B) Reprezentatywne mapy prawdopodobieństwa obszaru inwazji wykorzystywane w analizie segmentacji. (C) Gleiasfery rekurencyjne leczone lekiem X wykazywały znacznie mniejszy potencjał inwazyjny w porównaniu z gliomasphere leczonymi przez pojazd. Ilościowa identyfikacja obszaru inwazyjnego po 72 godzinach wykazała istotnie zmniejszoną inwazję gliomafer leczonych lekiem X, co zostało przedstawione jako całkowita powierzchnia pokryta w chwili fiksacji. Dane reprezentują obszar inwazji w czasie od n=3 niezależnych replikacji. Istotność statystyczna oceniono za pomocą niesparowanego testu T; p < 0,005 oznaczany jest przez **. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70365/70365fig5large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/70365/70365fig6.jpg" /> 
Rysunek 6: Migracja i ekspresja markerów komórek macierzystych po leczeniu. Glejaki opisane na Rysunku 5 zostały unieruchomione po migracji i immunobarwione za pomocą przeciwciała skierowanego do markera komórek macierzystych glejaka CD44 po leczeniu pojazdem lub lekiem X. Ten rysunek pokazuje, jaki rodzaj multipleksowanej analizy po migracji można przeprowadzić przy użyciu standardowych technik immunodowaniowania. Zdjęcia pokazują CD44-FITC (zielony) oraz Hoechst (jądra, niebieski). Pasek skali = 200 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70365/70365fig6large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figury.</a> 
Plik uzupełniający 1: Ponowne zapisywanie plików CZI z mikroskopu z wieloma scenami jako pojedynczych scen jako pliki TIF.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70365/1._Export_Multiscene_as_Tiff_v02.ijm" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Plik uzupełniający 2: Generowanie map prawdopodobieństwa przy użyciu modelu Weki.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70365/2._WEKA_segmentation_v02.ijm" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Plik uzupełniający 3: Analiza segmentacji bez progu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70365/3._Segmentation_analysis_v01.ijm" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Plik uzupełniający 4: Analiza segmentacji z progiem. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70365/3._Segmentation_analysis_v02.ijm" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>

Przedstawiamy trójwymiarowy model migracji glejaka glejaka wykorzystującego magnetyczne gliomasfery pochodzące od pacjentów, generowane z nowo zdiagnozowanych i nawracających guzów. Platforma ta umożliwia wizualizację specyficznych dla pacjenta dynamiki migracji oraz ocenę skuteczności terapeutycznej. Test może być multipleksowany po migracji, aby ocenić lokalizację i wzorce ekspresji białek.

Powtarzalny 3D test migracji glejaka z magnetyczną lokalizacją sferoidów za pośrednictwem nanocząstek magnetycznych w warunkach hipoksycznych

We describe a reproducible 3D migration assay to model the migratory and invasive potential of patient-derived glioblastoma gliomaspheres from newly ...

Skupiliśmy się na wizualnym uchwyceniu migracji guza glejaka glejakowego, co pozwala na wiarygodne i powtarzalne badania właściwości antyinwazyjnych terapii. Niesamowita heterogeniczność glejaka jest trudna do zmodelowania. Protokół ten rejestruje inwazjność guza glejaka pojedynczego w sposób powtarzalny.Aby zacząć od pozyskania glejaków w kolbice hodowli i utrzymywania wszystkich odczynników gotowych w warunkach sterylnych. Za pomocą 10-mililitrowej pipety serologicznej i pomocy pipetowej pobierz gliomafery z kolby. Przenieś gliomafery do stożkowej rurki o pojemności 15 mililitrów.Wiruj w 300g przez trzy minuty i wyrzuć supernatant bez zakłócania granulki komórkowej. Ponownie zawiesij granulat w jednomililitrowej Accutaze w temperaturze pokojowej. Użyj pipety P-1000, aby mieszać roztwór co dwie do trzech minut i inkubować przez łącznie 10 do 15 minut.Po inkubacji należy dodać równą objętość ośrodka gliomasphere do zawiesiny komórkowej, aby dezaktywować Accutazę. Wiruj zawiesinę jednokomórkową w stężeniu 300g przez trzy minuty w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnie ponownie zawiesij osad komórkowy w trzech do pięciu mililitrach kompletnego medium gliomasphere, w zależności od wielkości pelletu.Zwróć uwagę na dokładną objętość używaną do kolejnego liczenia komórek. Weź 10-mikrolitrową aliquot jednokomórkowej zawiesiny i delikatnie wymieszaj ją z 10 mikrolitrami trypan blue w rurce mikrowirówki o pojemności 1,5 mililitra. Załaduj 10 mikrolitrów tej mieszanki do automatycznego licznika ogniw.Przygotuj mieszankę głównych komórek glejaka w ośrodku glejaka zawierającą jeden mikrogram na mililitr propidiu jodku oraz 0,05 mikrolitra nanocząsteczek tlenku żelaza. Zasiać 500 pojedynczych komórek glejaka na dołek z tej mieszanki głównej do mikropłytki sferoidalnej o ultra-niskim przyczepieniu 96 dołków. Inkubuj płytkę przez 48 godzin w temperaturze 37 stopni Celsjusza, 5% dwutlenku węgla i 21% tlenu w nawilżonym inkubatorze do hodowli komórek, aby umożliwić powstanie gliomasphere.Aby przygotować Matrigel, rozcieńcz macierz zewnętrzną Matrigel w stosunku 1:10 w lodowatym ośrodku kompletnej neurosfery po 48 godzinach od powstania gliomasphere. Wykonaj drugie rozcieńczenie 1:10, aby uzyskać roztwór roboczy Matrigel. Trzymaj rozcieńczony Matrigel na lodzie.Schłodź płytę obrazową i przechowuj ją na lodzie. Do każdego dołka mikroprzezroczystej płytki dna należy podać 50 mikrolitrów roztworu roboczego Matrigel. Inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez co najmniej godzinę.Następnie usuń 30 mikrolitrów z każdego dołku, pozostawiając 20 mikrolitrów polimeryzowanego Matrigelu pokrywającego dno każdego dołku. Spryskaj magnetyczną płytę 70% etanolem i wytrzyj w sterylnych warunkach. Umieść mikropłytkę pokrytą Matrigelem na magnetycznym napędzie płytowym z 96 dołkami.Pipeta 80 mikrolitrów pożywki zawierającej pojedynczą gliomaferę z każdego dołku. Delikatnie rozłóż go na talerz pokryty Matrigelem. Traktuj sferoidy zgodnie z projektem eksperymentalnym.Teraz przenieś płytę z napędem magnetycznym do systemu obrazowania na żywo. Konfiguruj programowalny mikroskop z odwróconymi żywymi komórkami do pozyskiwania obrazów żywych komórek. Ustaw kamerę na 2x2 Binning.Delikatnie załaduj płytkę wielowarstwową bez napędu magnetycznego do mikroskopu. Dostosuj stopień mikroskopu, przyspieszenie i prędkość do 10%. Jeśli to możliwe, wybierz materiał płyty w oprogramowaniu, aby optyka była dostosowana do odpowiedniego poziomu. Dostosuj powiększenie, aby objął całe pole widzenia inwazyjnego.Skup się na gliomasphere i wybierz obiektyw 5X oraz soczewkę 0,5X, aby uzyskać powiększenie 2,5X. Sprawdź zarówno kontrast gradientu fazowego, światło przepuszczone, jak i kanały fluorescencji. Dostosuj czas naświetlania i intensywność światła, aby uniknąć nadmiernej ekspozycji.Przypisz pozycję zawierającą współrzędne x, y i z. Użyj sprzętowego autofokusowania, aby zapewnić spójne obrazowanie tej samej płaszczyzny ogniskowej. Glejaki, pochodzące z nowo zdiagnozowanych i nawracających guzów pacjentów, wykazywały podwójne fenotypy oraz losowe powiązania komórka-komórka.Obrazy światła przepuszczonego gliomasphere hodowane przez 48 godzin ukazały ciemny, plamkowany wygląd gliomafer zawierających nanocząstki tlenku żelaza. Glejowafery hodowane bez nanocząstek wykazywały losową lokalizację, podczas gdy te hodowane z nanocząstkami wykazywały spójną lokalizację centralną. Reprezentatywne obrazy światła transmitowanego wykazały dynamikę inwazji w godzinach zerowych i 72 godzinach w glejakach leczonych pojazdem oraz glejowakach leczonych lekiem X.Ilościowa identyfikacja obszaru inwazyjnego po 72 godzinach, mierzona jako całkowity obszar pokryty w momencie fiksacji, wykazała istotnie zmniejszoną inwazję glejowaków leczonych lekiem X w porównaniu z grupami kontrolnymi leczonymi pojazdami. Protokół ten umożliwia skalowalną, wysokoprzepustową analizę specyficznych zmian migracji guza glejaka w odpowiedzi na różne schorzenia i nasze terapie. Optymalizacja stężenia tlenku żelaza zapewnia minimalne zużycie i kontrolowane pozycjonowanie sterydów, znacznie poprawiając spójność, dokładność i ogólną wydajność testu.Przyszłe badania mogą opracować bardziej reprezentatywne macierze ECM mózgu, aby lepiej naśladować migrację glejaka i tym samym poprawić znaczenie translacyjne w systemach in vitro.

reproducible-3d-glioblastoma-migration-assay-with-magnetic

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Źródło: Guyon, J., et al. Model sferoidalny 3D glejaka. J. Vis. Exp. (2020)Film demonstruje generowanie trójwymiarowego sferoidalnego modelu inwazji komórek nowotworowych. Sferoidy są tworzone z ludzkich komórek nowotworowych mózgu i osadzone w macierzy kolagenowej. Komórki nowotworowe na obrzeżach sferoidy przyjmują fenotyp inwazyjny, wydzielając proteazy w celu degradacji kolagenu i posuwając się do inwazji na otaczającą macierz.

Generowanie trójwymiarowego sferoidalnego modelu inwazji komórek nowotworowych

Źródło: Pericoli, G. et. al., Testy immunocytochemiczne żywych komórek 3D rozlanego glejaka linii środkowej u dzieci. J. Vis. Exp. (2021)Ten film przedstawia obrazowanie żywych komórek w celu obserwacji migracji komórek glejaka rozlanego w linii środkowej u dzieci za pomocą znakowania immunohistochemicznego przeciwciałami anty-CD44.

Obrazowanie oparte na immunocytochemii do wizualizacji migracji komórek glejaka u dzieci

Inwazja otaczających normalnych tkanek jest cechą charakterystyczną nowotworów złośliwych. Przedstawiamy tutaj prosty, półautomatyczny test mikropłytki inwazji do naturalnej biomatrycy 3D, który został zilustrowany za pomocą wielu modeli zaawansowanych nowotworów u ludzi.

Trójwymiarowy (3D) test inwazji sferoidów guza

Tutaj opisana jest metoda przygotowania trójwymiarowej (3D) sferoidalnej kokultury komórek raka trzustki i fibroblastów, a następnie pomiaru funkcji metabolicznych za pomocą analizatora strumienia zewnątrzkomórkowego.

Otrzymywanie i oznaczanie metaboliczne 3-wymiarowych sferoidalnych kokultur komórek raka trzustki i fibroblastów

Tutaj opisujemy techniki obrazowania żywych komórek, aby ilościowo zmierzyć migrację i inwazję komórek macierzystych glejaka mózgu w czasie i w wielu warunkach leczenia.

Testy obrazowania żywych komórek w celu zbadania migracji i inwazji komórek macierzystych glejaka wielopostaciowego guza mózgu

Wpływ inhibitorów migracji na migrację komórek raka glejaka w trójwymiarowych (3D) testach inwazji z użyciem inhibitora deacetylazy histonowej (HDAC) charakteryzuje się mikroskopią konfokalną o wysokiej rozdzielczości.

Charakterystyka wpływu inhibitorów migrastatycznych na inwazję sferoidalną guza 3D za pomocą mikroskopii konfokalnej o wysokiej rozdzielczości

Mikrodysekcja laserowa (LMD) jest czułą i wysoce powtarzalną techniką, która może być wykorzystana do odkrycia ścieżek pośredniczących w heterogeniczności i inwazji glejaka. W tym miejscu opisujemy zoptymalizowany protokół izolacji dyskretnych obszarów z tkanki glejaka za pomocą laserowego LMD, a następnie analizy transkryptomicznej.

Mikrodysekcja podregionów glejaka do wychwytywania laserowego w celu przestrzennej i molekularnej charakterystyki heterogeniczności wewnątrznowotworowej, onkostrumieni i inwazji

Tutaj opisujemy łatwy w użyciu test na inwazję glejaka. Ten test jest odpowiedni dla komórek macierzystych podobnych do glejaka. Opisano również makro Fidżi do łatwego ilościowego określania inwazji, migracji i proliferacji.

Model sferoidalny 3D glejaka wielopostaciowego

Tutaj prezentujemy łatwy w użyciu test do analizy migracji glejaka (GBM) na neuronach o wzorcach. Opracowaliśmy makro w oprogramowaniu FiJi do łatwego ilościowego określania migracji komórek GBM na neuronach i zaobserwowaliśmy, że neurony modyfikują zdolność inwazyjną komórek GBM.

Wspólna hodowla komórek macierzystych podobnych do glejaka na neuronach wzorcowych w celu zbadania migracji i interakcji komórkowych

W tym miejscu tworzymy platformę profilowania metabolicznego integrującą trójwymiarowe (3D) sferoidy glejaka i normalizację opartą na obrazowaniu za pomocą analizy strumienia zewnątrzkomórkowego. Podejście to umożliwia dokładniejszą ocenę odpowiedzi metabolicznych guza na leczenie farmakologiczne i zapewnia wgląd w potencjalne mechanizmy oporności.

Postępy w profilowaniu metabolicznym trójwymiarowych sferoid guza mózgu do badań przesiewowych leków

Poznaj powtarzalny test migracji 3D glejaka z lokalizacją magnetyczną sferoidów w warunkach hipoksycznych. Ta metoda umożliwia badanie zachowań migracyjnych i inwazyjnych potencjału nowotworów pochodzących od pacjentów.

Powtarzalny 3D test migracji glejaka z magnetyczną lokalizacją sferoidów za pośrednictwem nanocząstek magnetycznych w warunkach hipoksycznych (Wideo) | JoVE Journal

Powtarzalny 3D test migracji glejaka z magnetyczną lokalizacją sferoidów za pośrednictwem nanocząstek magnetycznych w warunkach hipoksycznych

Przeglądaj więcej filmów