Name: Wykorzystanie mutantów Arabidopsis eceriferum do badania biosyntezy skórek roślin (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-05-31T22:16:00.000+00:00
Duration: 11 min 2 s
Description: Odkryj analizę mutantów skórki roślinnej Arabidopsis eceriferum przy użyciu genetyki do przodu i wstecz. Ta metoda pozwala zrozumieć biosyntezę wosków i ich rolę w ochronie roślin przed patogenami.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

I. Przesiewy wizualne i podejścia genetyki odwrotnej w celu identyfikacji mutantów kutykuli.
Mutanty kutykuli u rośliny modelowej Arabidopsis thaliana nazywane są mutantami „eceriferum”, co oznacza „nieprodukujące wosku”. Można je zidentyfikować w badaniach wizualnych, co oznacza, że już na podstawie wyglądu mutanta można zauważyć, że łodyga kwiatostanu roślin typu dzikiego jest biaława, podczas gdy mutanty mają ciemnozielone, błyszczące łodygi.&nbsp; Jednym z mutantów wyizolowanych w tego typu badaniach wizualnych jest mutant zwany eceriferum4 lub cer4.&nbsp; Innym sposobem odkrywania interesujących mutantów kutykuli jest podejście genetyki odwrotnej: wybór genów kandydackich, a następnie badanie linii roślin z przerwanym działaniem tych genów.&nbsp;Mutanty te posiadają TDNA przerywające gen docelowy, w tym przypadku cytochrom P450, który obecnie nazywamy MAH1. Wyniki PCR (takie jak pokazane na filmie) mogą potwierdzić, że insercja TDNA znajduje się w genie docelowym. Gdy do amplifikacji DNA typu dzikiego używa się dwóch starterów specyficznych dla genu, otrzymujemy produkt, ale jeśli TDNA go przerywa, jak w przypadku tego mutanta, produkt nie powstaje.&nbsp; I odwrotnie, przy użyciu starterów specyficznych dla TDNA i genu, produkt jest widoczny tylko u mutanta.&nbsp;Poszukujemy homozygotycznych linii mutantów, w których obie kopie genu — macierzysta i ojcowskia — są przerwane.&nbsp;Jeśli jedna kopia genu jest przerwana przez TDNA, a druga kopia jest wciąż typu dzikiego, wyniki PCR są mieszane.
II.&nbsp; Wykorzystanie chromatografii gazowej do oznaczenia składu chemicznego wosku kutykularnego.&nbsp;
Analizujemy skład chemiczny wosku za pomocą chromatografii gazowej.&nbsp;W pierwszej kolejności rozpuszczalne związki wosku są usuwane z powierzchni rośliny poprzez zanurzenie jej w chloroformie.
Następnie próbki są wstrzykiwane do kolumny chromatograficznej, gdzie są podgrzewane i transportowane w strumieniu gazu.&nbsp;Różne związki w różnym stopniu przylegają do ścianek kolumny, co prowadzi do ich rozdzielenia, w wyniku czego opuszczają one kolumnę jeden po drugim.&nbsp;Kiedy związki przechodzą przez detektor jonizacji płomieniowej, rejestrowane są piki.&nbsp;Czas retencji każdego piku jest charakterystyczny dla poszczególnych związków, a dzięki spektrometrii mas zidentyfikowano każdy z komponentów wosku Arabidopsis.&nbsp;Główne piki odpowiadają alkanowi C29, ketonowi C29 oraz wtórnemu alkoholowi C29.&nbsp;Mniejsze piki to alkohole wtórne, kwasy tłuszczowe, aldehydy i estry. Pole pod pikami, w odniesieniu do standardu, informuje o ilości każdego z obecnych związków. Analizując chromatogramy gazowe mutantów kutykuli, można zauważyć, że w linii cer4 brakuje alkoholi pierwszorzędowych i estrów, natomiast w mah1 brakuje alkoholi wtórnych i ketonów.&nbsp;Fenotypy te mogą dostarczyć wielu informacji na temat funkcji badanego genu w roślinie.&nbsp;Na przykład, zanim zidentyfikowano gen zmutowany w linii cer4, fenotyp wskazywał na problem w odgałęzieniu biosyntezy alkoholi pierwszorzędowych.&nbsp;Po zbadaniu tożsamości molekularnej tego genu w laboratorium Kunst odkryto, że należy on do rodziny genów reduktaz acyloacylu, co jest spójne z tym fenotypem chemicznym.
III. Wykorzystanie Cryo-SEM do oznaczenia struktury kryształów kutykuli
Podczas badania mutantów kutykuli Arabidopsis możemy zaobserwować, czy wykazują one ciemnozielony, błyszczący fenotyp, czy też typowy dla typu dzikiego białawy wygląd łodygi.&nbsp;Używamy skaningowego mikroskopu elektronowego, aby zbadać kutykulę na powierzchni rośliny i zidentyfikować podstawę wizualnego fenotypu.&nbsp;Stosujemy cryo-SEM, zamrażając rośliny i obserwując je w temperaturze ciekłego azotu, aby zachować nienaruszoną kutykulę, ponieważ SEM wymaga do pracy próżni, a bez zamrożenia próbki uległyby wysuszeniu i zapadnięciu. Tutaj próbki cer4 i mah1, wraz z kontrolami typu dzikiego, są preparowane i zamrażane na stubie do SEM.&nbsp;Po przeniesieniu próbek na chłodny stolik mikroskopu widać, że powierzchnia kutykuli łodygi Arabidopsis typu dzikiego jest pokryta kryształkami.&nbsp;To właśnie światło rozproszone na tych kryształkach nadaje łodydze białawy wygląd.&nbsp;Oto łodyga cer4; pamiętacie, że wyglądała na błyszczącą?&nbsp;Brakuje na niej kryształków na powierzchni. Przeprowadzano eksperymenty, w których izolowano czysty związek woskowy z kutykuli rośliny, a po jego rekrystalizacji w laboratorium kryształy przybierały te same kształty, co te znalezione na roślinach. W przypadku Arabidopsis uważamy, że kryształy składają się z mieszaniny związków i sytuacja jest bardziej skomplikowana.&nbsp; Na przykład analiza chemiczna wykazuje, że w cer4 brakuje jedynie mniejszego składnika w postaci alkoholi pierwszorzędowych i ich estrowych pochodnych, a mimo to kryształki na łodydze cer4 zniknęły.&nbsp;W przypadku mah1 efektem mutacji w tym enzymie cytochromu P450 jest brak dwóch głównych składników wosku w roślinach mutantach – alkoholi wtórnych i ketonów – jednak kryształki na roślinach mah1 tworzą się prawidłowo. Aby dowiedzieć się więcej o mutantach kutykuli Arabidopsis, prosimy odwiedzić stronę <a href="http://arjournals.annualreviews.org/doi/abs/10.1146/annurev.arplant.59.103006.093219" target="_blank">Annual Review of Plant Biology</a>.

wykorzystanie mutantów arabidopsis eceriferum do badania biosyntezy kutykuli roślinnej

Use of Arabidopsis eceriferum Mutants to Explore Plant Cuticle Biosynthesis

Kutykula roślinna to woskowa zewnętrzna powłoka roślin, której główną rolą jest zapobieganie utracie wody, ale stanowi ona również istotną barierę przed wnikaniem mikroorganizmów patogennych. Kutykula składa się z wytrzymałego polimeru sieciowanego, nazywanego kutyną, oraz ochronnej warstwy wosku, która uszczelnia powierzchnię rośliny. Woskowa warstwa kutykuli jest wyraźnie widoczna u wielu roślin, przejawiając się jako błyszcząca błona na liściu bluszczu lub jako matowa zewnętrzna powłoka na powierzchni winogrona bądź liścia kapusty, co jest wynikiem obecności kryształów rozpraszających światło w wosku. Ponieważ kutykula jest kluczową adaptacją roślin do środowiska lądowego, zrozumienie genów zaangażowanych w jej tworzenie ma zastosowanie zarówno w rolnictwie, jak i w leśnictwie. Dzisiaj zaprezentujemy analizę mutantów kutykuli roślinnej zidentyfikowanych za pomocą metod genetyki typu forward oraz reverse.

Kutykula roślinna to woskowa zewnętrzna powłoka roślin, której główną funkcją jest zapobieganie utracie wody, ale stanowi ona również istotną barierę przeciwko wnikaniu mikroorganizmów patogennych. W tym filmie prezentujemy analizę mutantów kutykuli roślinnej zidentyfikowanych za pomocą metod genetyki forward i reverse.

Wykorzystanie mutantów Arabidopsis eceriferum do badania biosyntezy kutykuli roślinnej

Kutykula roślinna to woskowa zewnętrzna powłoka roślin, której główną rolą jest zapobieganie utracie wody, ale stanowi ona również istotną barierę przeciwko wnikaniu...

Kutykula roślinna to woskowa zewnętrzna powłoka roślin, której główną rolą jest zapobieganie utracie wody, ale stanowi ona również ważną barierę przed wnikaniem drobnoustrojów chorobotwórczych. Kutykula składa się z wytrzymałego polimeru sieciowanego zwanego kutyną oraz ochronnej warstwy wosku, która uszczelnia powierzchnię rośliny. Woskowa warstwa kutykuli jest wyraźnie widoczna u wielu roślin, przejawiając się jako błyszcząca błona na liściu bluszczu lub jako pylista zewnętrzna powłoka na powierzchni winogrona lub liścia kapusty.Dzięki kryształkom rozpraszającym światło obecnym w wosku, kutykula stanowi kluczową adaptację roślin do środowiska lądowego. Zrozumienie genów zaangażowanych w formowanie kutykuli roślin ma zastosowanie zarówno w rolnictwie, jak i w leśnictwie. Dzisiaj zaprezentujemy analizę kutykuli roślinnej MUS, zidentyfikowanej za pomocą podejść genetyki w przód oraz genetyki wstecznej.Witajcie, nazywam się Patricia Lam i pracuję w laboratorium Lyrica Kunz w Katedrze Botaniki na UVC. Dziś wraz z pozostałymi osobami pokażemy Państwu, w jaki sposób można badać te rośliny, aby zrozumieć, jak syntetyzują one konkretne woski. Jestem Meen z laboratorium Brain Heart Jet na

use-arabidopsis-eceriferum-mutants-to-explore-plant-cuticle

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Wykorzystanie mutantów Arabidopsis eceriferum do badania biosyntezy skórek roślin

Nadziemne organy roślin są chronione przez kutykulę, która stanowi supramolekularny kompleks biopoliestru i wosków. Przedstawiamy protokoły monitorowania selektywnego usuwania wosków epikutykularnych i intrakutykularnych z kutykuli owoców pomidora w skalach molekularnej i mikro, odpowiednio za pomocą NMR w stanie stałym oraz mikroskopii sił atomowych, a także oceny zdolności do sieciowania zmodyfikowanych biopoliestrów kutykularnych.

Izolacja i badanie biofizyczne kutykuli owoców

Opisujemy protokół z wykorzystaniem szkiełek z komorami oraz pośrodków do unieruchamiania liści zasadniczych roślin w celu obrazowania konfokalnego epidermy przez kilka dni rozwoju, co pozwala na dokumentowanie różnicowania szparek. Białka znakowane fluoroforami mogą być śledzone dynamicznie poprzez analizę ich ekspresji i lokalizacji subkomórkowej, co zwiększa zrozumienie ich potencjalnych ról podczas podziału komórek i różnicowania typów komórek.

Długoterminowe obrazowanie poklatkowe wysokiej rozdzielczości konfokalne epidermy zawilżnych liści przeciwstawnych Arabidopsis podczas kiełkowania

Przedstawiamy procedurę składania testu na ściółkę nasienną (SCBA) z nasion Arabidopsis thaliana. Wykazano, że aparat oddechowy jest potężnym narzędziem do genetycznego i in vitro, w jaki sposób bielmo kontroluje kiełkowanie nasion w uśpionych nasionach i w odpowiedzi na sygnały świetlne. Aparat oddechowy ma zasadniczo zastosowanie w każdej sytuacji, w której podejrzewa się, że bielmo wpływa na wzrost zarodka.

Test ściółki nasiennej do genetycznego zbadania in vitro, w jaki sposób bielmo kontroluje kiełkowanie nasion u Arabidopsis thaliana

Skład ściany komórkowej rośliny różni się w zależności od typu tkanki i może zawierać ligninę, celulozę, hemicelulozy i pektyny. Opracowano różne techniki barwienia w celu wizualizacji różnic na poziomie typu komórki. Niniejszy artykuł jest kompilacją powszechnie stosowanych technik barwienia ścian komórkowych.

Barwienie histochemiczne drugorzędowych elementów ściany komórkowej Arabidopsis thaliana

Poliestry lipidowe stanowią składniki strukturalne dwóch modyfikacji ściany komórkowej, naskórka roślinnego i barier dyfuzyjnych zawierających suberynę. W tym filmie opisujemy metodę depolimeryzacji kutyny z całych zdelipidowanych liści. Metoda ta może być stosowana do badania mutantów upośledzonych w biosyntezie kutyny lub suberyny.

Izolacja i analiza składu monomerów lipidowych poliestrowych naskórków roślin

Immunoprecypitacja chromatyny to potężna technika identyfikacji miejsc wiązania DNA białek Arabidopsis in vivo. Procedura ta obejmuje sieciowanie i fragmentację chromatyny, immunoprecypitację selektywnymi przeciwciałami przeciwko białku będącemu przedmiotem zainteresowania oraz analizę qPCR związanego DNA. Opisujemy prosty test ChIP zoptymalizowany dla roślin Arabidopsis.

Test immunoprecypitacji chromatyny do identyfikacji interakcji białko-DNA Arabidopsis in vivo

Ten protokół przedstawia metodę obserwacji embriogenezy u Arabidopsis poprzez usuwanie zalążków, a następnie kontrolę tworzenia się wzorów zarodków pod mikroskopem.

Metoda charakteryzowania embriogenezy u Arabidopsis

Dostępny jest protokół o wysokiej przepustowości do powierzchniowej sterylizacji nasion Arabidopsisthaliana (Arabidopsis), optymalizujący etapy obsługi cieczy za pomocą prostego urządzenia ssącego zbudowanego z pompą próżniową. Setki próbek nasion można wysterylizować powierzchniowo w ciągu jednego dnia.

Wysokowydajna, wytrzymała i bardzo elastyczna w czasie metoda powierzchniowej sterylizacji nasion rzodkiewnika

Protokół wgłębień mikroskopii sił atomowych oferuje możliwość przeanalizowania roli fizycznych właściwości ściany komórkowej konkretnej komórki tkanki lub organu podczas normalnego lub ograniczonego wzrostu (tj. przy niedoborze wody).

Mikroskopia sił atomowych w celu zbadania właściwości fizycznych komórek naskórka żywych korzeni rzodkiewnika

Ten protokół opisuje solidną metodę szczepienia sadzonek, która nie wymaga wcześniejszego doświadczenia ani szkolenia i może być wykonana bardzo niskim kosztem przy użyciu materiałów łatwo dostępnych w większości laboratoriów biologii molekularnej.

Skalowalne, elastyczne i ekonomiczne szczepienie sadzonek

Ten artykuł opisuje dwie metody fenotypowania bez użycia peelingów naskórka do scharakteryzowania genów kontrolujących rozwój aparatów szparkowych. Pierwsza metoda pokazuje, jak analizować fenotyp aparatów szparkowych przy użyciu naskórka roślinnego barwionego błękitem O-toluidyny. Druga metoda opisuje, w jaki sposób identyfikować ligandy szparkowe i monitorować ich aktywność biologiczną.

Identyfikacja genów zaangażowanych w rozwój aparatów szparkowych poprzez ocenę fenotypu naskórka

Odkryj analizę mutantów skórki roślinnej Arabidopsis eceriferum przy użyciu genetyki do przodu i wstecz. Ta metoda pozwala zrozumieć biosyntezę wosków i ich rolę w ochronie roślin przed patogenami.

Wykorzystanie mutantów Arabidopsis eceriferum do badania biosyntezy kutykuli roślinnej

Przeglądaj więcej filmów