Name: Od MEF do Matrigel 3: Pasażowanie hESC z Matrigel do Matrigel (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-06-10T15:33:00.000+00:00
Duration: 3 min 50 s
Description: Poznaj metodę pasażowania ludzkich komórek macierzystych zarodkowych (hESC) w warunkach bezwarstwy pokarmowej na podłożu Matrigel. Technika obejmuje zastosowanie dispazy, ocenę pluripotencji metodą immunofluorescencji oraz utrzymanie zdrowych kolonii komórkowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Badania nad ludzkimi embrionalnymi komórkami macierzystymi w laboratorium Teitella są wspierane przez grant zasiewowy RS1-00313 z California Institute for Regenerative Medicine (CIRM). Dziękujemy członkom Broad Center of Regenerative Medicine and Stem Cell Research na UCLA, w szczególności dr Amander Clark, dr Jerome Zack oraz członkom UCLA Broad Institute Stem Cell Core Facility za wsparcie naszych badań.

Przesadzanie hESC z Matrigelu na Matrigel
Zazwyczaj konfluencyjną płytkę 6-dołkową z hESC na Matrigelu można przesadzić w stosunku od 1:3 do 1:5 na inną płytkę z Matrigelem, a dołki ponownie stają się konfluencyjne 4-5 dni po przesadzeniu.
<ol>
<li>Przed pasażowaniem przygotowuje się płytki z CM oraz Matrigel zgodnie z powyższym opisem.</li>
<li>W dniu pasażowania każdą studnię przeznaczoną do podziału przemywa się 1×PBS, pH7.4, następnie do każdej studni dodaje się 1ml Dispase o stężeniu 1mg/ml (roztwór stokowy 5mg/ml rozcieńczony w medium DMEM/F12) i inkubuje w temperaturze 37°C przez 3 min.</li>
<li>Każdą studnię przemywa się trzykrotnie 1×PBS, pH7.4, dodaje 1ml medium ES bez bFGF, a następnie za pomocą skrobaka do komórek zdejmuje kolonie z dna studni. Zawiesinę hESCs zbiera się do probówki typu Falcon o pojemności 50ml i pelletuje poprzez wirowanie przy 200g przez 5 min w temperaturze pokojowej.</li>
<li>Aby ponownie wysiać hESCs na płytkach z Matrigel, najpierw przemywa się płytki z Matrigel medium DMEM/F12 i dodaje do każdej studni 2,5ml CM uzupełnionego o 10ng/ml bFGF. Pellet hESC resuspenduje się w odpowiedniej objętości CM uzupełnionego o 10ng/ml bFGF, pipetując zawiesinę komórkową trzy razy w górę i w dół. (UWAGA: Gdy hESCs do pasażowania pochodzą z płytek z Matrigel, agregaty są bardzo łatwe do rozbicia; zatem trzy cykle pipetowania są wystarczające, a nadmierne pipetowanie może doprowadzić do zbyt silnej dysocjacji kolonii i powstania pojedynczych komórek). Do każdej studni 6-dołkowej płytki z Matrigel przenosi się po 0,5 ml zawiesiny agregatów hESC, aby uzyskać końcową objętość 3ml na studnię. Płytkę umieszcza się w inkubatorze w temperaturze 37°C.</li>
</ol>
Wykrywanie markerów pluripotencji za pomocą mikroskopii immunofluorescencyjnej
Mikroskopia immunofluorescencyjna jest wykorzystywana do badania ekspresji markerów pluripotencji hESC, Oct-4 i SSEA-4, podczas hodowli.
<ol>
<li> Odessać pożywkę z jednej studzienki i przemyć 1×PBS, pH 7.4. Dodać do studzienki 2ml 3,7% formaldehydu i utrwalać przez 10 min. </li>
<li>Przepłukać 1xPBS, pH 7.4, dodać do studzienki 2ml metanolu i inkubować w temperaturze -20°C przez 2 min. </li>
<li>Przepłukać 1xPBS, pH 7.4 i blokować 1ml 0,2% albuminy surowiczej bydlęcej (BSA) przez 5 min. </li>
<li>Dodać 1ml przeciwciała Oct-4 lub anty-h/mSSEA-4 (rozcieńczenie 1:200 w 0,2% BSA) i inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 h lub w 4°C przez noc. (UWAGA: w przypadku barwienia SSEA-4 należy przejść bezpośrednio do kroku 6) </li>
<li>Przepłukać trzykrotnie 1xPBS, pH 7.4, dodać królika IgG sprzężonego z FITC (rozcieńczenie 1:500 w 0,2% BSA) i inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 h. </li>
<li>Przepłukać 3 razy 1xPBS, pH 7.4 i nanieść kroplę medium montażowego (może zawierać DAPI, jeśli wymagana jest wizualizacja jąder) na środek studzienki. Położyć szkiełko nakrywkę na komórkach, uszczelnić lakierem do paznokci i ocenić za pomocą mikroskopii immunofluorescencyjnej.</li>
</ol>
Protokoły dotyczące ludzkich embrionalnych komórek macierzystych
Pożywka ES (pożywka dla embrionalnych komórek macierzystych):
DMEM/F12 - 400ml zamiennik surowicy Knockout Serum Replacer - 100ml nieessentialne aminokwasy - 5ml roztwór 200mM GlutaMax / BME - 5ml penicylina / streptomycyna - 5ml
Dokładnie wymieszać i przechowywać końcową pożywkę do hodowli hESC w butelkach o pojemności 500ml w temperaturze 4°C. Przechowywać maksymalnie przez dwa tygodnie.
Pożywka do hodowli MEF:
DMEM - 1000ml FBS - 100ml Niezbędne aminokwasy (NEAA) - 10ml Glutamina - 10ml Penicylina / Streptomycyna - 10ml
Wymieszać dokładnie i przechowywać gotowe MEF Culture Media w temperaturze 4°C.
Roztwór 200mM Glutamax / BME:
Glutamax – 100ml β-merkaptoetanol (roztwór zapasowy o stężeniu 14,3M) – 140 µ1 Dokładnie wymieszać oba roztwory, a następnie podzielić na alikwoty po 10ml. Przechowywać alikwoty w temperaturze -20°C. Roztwór bFGF (stężenie końcowe roztworu zapasowego: 10 micrograms/ml): bFGF (FGF2) – 50 µg 0,1% BSA w 1xPBS, pH 7,4 – 5ml
Rozpuścić 50 µg bFGF w 5 ml 0,1% BSA, aby przygotować roztwór zapasu o stężeniu 10 µg/ml. Podzielić na aalikwoty po 500 µl. Przechowywać w temperaturze -80°C.
Roztwór kolagenazy IV (1mg/ml):
Kolagenaza IV - 50mg Pożywka DMEM/F12 - 50ml
Wsyp proszek kolagenazy IV do probówki typu Falcon o pojemności 50 ml. W komorze z laminarnym przepływem powietrza dodaj 50 ml sterylnego medium DMEM/F12. Mieszaninę wstrząsaj w wibratorze Vortex przez &lt; 1 min., aby upewnić się, że proszek został rozpuszczony. W komorze z laminarnym przepływem powietrza przefiltruj roztwór przez filtr 0,22 µm do nowej sterylnej probówki typu Falcon o pojemności 50 ml. Roztwór ten można przechowywać w temperaturze 4°C przez maksymalnie 2 tygodnie.
Roztwór dispazy (1mg/ml):
Dyspaza 5mg/ml - 2ml Pożywka DMEM/F12 - 8ml Rozdziel handlowy roztwór dyspazy o stężeniu 5mg/ml na alikwoty i przechowuj w temperaturze -20°C. Rozcieńcz dyspazę do stężenia 1mg/ml, używając pożywki DMEM/F12. Roztwór ten można przechowywać przez 1 tydzień w temperaturze 4°C.

<ol><li>Thomson, J. amesA., Itskovitz-Eldor, J. oseph, Shapiro, S. anderS., Waknitz, M. ichelleA., Swiergiel, J. enniferJ., Marshall, V. ivienneS., Jones, J. effreyM. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+Stem+Cell+Lines+Derived+from+Human+Blastocysts+%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Embryonic Stem Cell Lines Derived from Human Blastocysts .</a> Science. 282, 1145-1147 (1998).</li>
<li>Xu, C. hunhui, Inokuma, M. argaretS., Denham, J. errod, Golds, K. athaleen, Kundu, P. ratima, Gold, J. osephD., Carpenter, M. elissaK. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((+Feeder-free+growth+of+undifferentiated+human+embryonic+stem+cells+Nature+Biotechnology+19%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)"> Feeder-free growth of undifferentiated human embryonic stem cells Nature Biotechnology 19.</a> Nature Biotechnology. 19, 971-974 (2001).</li>
</ol>

Ta seria 3 filmów demonstruje, jak hodować ludzkie embrionalne komórki macierzyste (hESCs) na komórkach karmicielskich z zarodkowych fibroblastów myszy (MEF) (film 1), jak przenosić je na płytki z Matrigel bez komórek karmicielskich (film 2) oraz jak utrzymywać hESCs poprzez pasażowanie w warunkach bez komórek karmicielskich na Matrigel (film 3). Liczne wcześniejsze badania wykazały, że utrzymanie żywotnych, niezdiferencjowanych hESCs wymaga hodowli na inaktywowanych komórkach karmicielskich MEF. Jednak do wielu eksperym...

<table><tbody><tr><td>Zamiennik surowicy KnockOut Serum Replacer (KSR)</td><td>Odczynnik</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>10828-028</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Odczynnik</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>11330-057</td><td></td></tr><tr><td> Aminokwasy nieesencjalne</td><td>Odczynnik</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMax </td><td>Odczynnik</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Odczynnik</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>11995-065</td><td></td></tr><tr><td>FBS (płytki surowica bydlęca)</td><td>Odczynnik</td><td>Clontech Laboratories</td><td>631107</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Odczynnik</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>BME</td><td>Odczynnik</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP176-100</td><td></td></tr><tr><td>bFGF</td><td>Odczynnik</td><td>R&amp;R&D Systems</td><td>233-FB-025</td><td></td></tr><tr><td>Kolagenaza IV</td><td>Odczynnik</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>17104-019</td><td></td></tr><tr><td>Dispase</td><td>Odczynnik</td><td>Technologie komórek macierzystych</td><td>17105-041</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina / Streptomycyna </td><td>Odczynnik</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Żelatyna</td><td>Odczynnik</td><td>Chemicon International</td><td>ES-006-B</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Odczynnik</td><td>BD Biosciences</td><td>354277</td><td></td></tr><tr><td>przeciwciało przeciwko Oct-4</td><td>Odczynnik</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.</td><td>SC-9081</td><td></td></tr><tr><td>przeciwciało anty-h/mSSEA-4 Phyc&amp;#8211;mysi IgG3 sprzężony z rytryną</td><td>Odczynnik</td><td>R&amp;D Systems</td><td>FAB1435P</td><td></td></tr><tr><td>anty-IgG przeciwko królikowi sprzężone z FITC</td><td>Odczynnik</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>715-095-152</td><td></td></tr></tbody></table>

od mef do matrigelu 3: pasażowanie hesc z matrigelu na matrigel

From MEFs to Matrigel 3: Passaging hESCs from Matrigel onto Matrigel

W niniejszym filmie zaprezentowano sposób utrzymania wzrostu ludzkich embrionalnych komórek macierzystych (hESC) w warunkach bez udziału komórek karmicieli oraz metodę ich ciągłego pasażowania w takich warunkach. Przedstawiono również potwierdzenie pluripotencji hESC hodowanych bez komórek karmicieli przy użyciu mikroskopii immunofluorescencyjnej.

W niniejszym filmie zaprezentowano sposób utrzymania wzrostu ludzkich embrionalnych komórek macierzystych (hESCs) w warunkach bez komórek karmionek oraz sposób ciągłego pasażowania hESCs w warunkach bez komórek karmionek. Przedstawiono również potwierdzenie pluripotencji hESCs hodowanych bez komórek karmionek za pomocą mikroskopii immunofluorescencyjnej. Część 3 z 3.

Od MEF do Matrigelu 3: Pasażowanie hESC z Matrigelu na Matrigel

W niniejszym materiale wideo zaprezentowano sposób utrzymania hodowli ludzkich embrionalnych komórek macierzystych (hESCs) w warunkach bez użycia komórek karmiących oraz sposób ich ciągłego pasażowania...

Aby rozdzielić ludzkie embrionalne komórki macierzyste hodowane na Matrigelu na dwa kolejne podłoża Matrigel. Zaczynamy od sześciodołkowej płytki z konfluencyjnymi embrionalnymi komórkami macierzystymi na matrigelu, które można rozdzielić w stosunku od 1:3 do 1:5 na inną płytkę z matrigelu. Pozwala to dołkom ponownie osiągnąć konfluencję cztery do pięciu dni po rozdzieleniu w dniu pasażowania.Każdą studzienkę przeznaczoną do podziału należy przemyć 1 XPBS pH 7.4. Następnie do każdej studzienki należy dodać 1 mL zawiesiny o stężeniu 1 mg/mL i inkubować w temperaturze 37°C przez 3 minuty. Każdą studzienkę należy przemyć trzykrotnie 1 XPBS pH 7.4.Następnie dodaj 1 mL pożywki do embrionalnych komórek macierzystych bez BF GF i za pomocą skrobaka do komórek zeskrob kolonie z dna dołka. Zbierz resuspensowane embrionalne komórki macierzyste do probówki Falcon o pojemności 15 mL i odwiruj w celu uzyskania osadu przy 200 ×g przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Aby ponownie wysiać ludzkie embrionalne komórki macierzyste na płytkach z matrigelem, najpierw przemyj płytki z matrigelem pożywką D-M-E-M-F 12, a następnie dodaj 2,5 mL pożywki kondycjonowanej z dodatkiem 10 ng/ml.BFGF na studzienkę. Po odwirowaniu komórek ponownie zawiesić osad ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych z ucha w odpowiedniej objętości pożywki uzupełnionej o 10 ng/ml BFGF. Przenieść zawiesinę komórkową pipetą w górę i w dół trzykrotnie.Należy pamiętać, że skupiska komórek macierzystych z matrigelu łatwo ulegają rozpadowi. Dlatego trzykrotne pipetowanie powinno wystarczyć do rozbicia skupisk, nie sprawiając jednocześnie, że kolonie staną się zbyt małe. Na koniec należy nanieść do każdej dołki 0,5 mililitra zawiesiny ludzkich komórek macierzystych, aby uzyskać łącznie trzy mils na dołkę.Jako końcową objętość upewnij się, że skupiska komórek są równomiernie rozproszone, a następnie umieść płytkę w inkubatorze w temperaturze 37°C. W zależności od konkretnej linii komórek macierzystych amry, komórki macierzyste amry ponownie osiągną konfluencję od czterech do pięciu dni po pasażowaniu. Gdy kolonie zaczną się ze sobą stykać, istotne jest ustalenie, czy ludzkie komórki macierzyste amry zachowują pluripotencję lub cechy macierzystości w hodowli.Aby sprawdzić pluripotencję komórek podczas hodowli mezenchymalnych komórek macierzystych, stosujemy mikroskopię immunofluorescencyjną w celu zbadania ekspresji markerów pluripotencji, OCT4 oraz SSEA4, w jednej z studni. Nasza płytka 6-dołkowa zostaje utrwalona i barwiona pod kątem OCT4 i SSEA4. Jeśli zaobserwujemy, że komórki są fluorescencyjnie znakowane dla obu tych markerów, oznacza to, że ludzkie embrionalne komórki macierzyste zachowały pluripotencję i mogą zostać wykorzystane w naszych eksperymentach.Właśnie pokazaliśmy Państwu, jak hodować i utrzymywać potencjalne ludzkie embrionalne komórki macierzyste, w tym komórki embrionalne, fibroblasty oraz komórki pokarmowe, a także w warunkach wolnych od komórek pokarmowych na podłożu Matrigel. To wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w Państwa eksperymentach.

from-mefs-to-matrigel-3-passaging-hescs-from-matrigel-onto-matrigel

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Od MEFs do Matrigel 3: Przenoszenie hESC z Matrigel na Matrigel

W tym filmie pokazujemy, jak w naszym laboratorium rutynowo fragmenty barwy linii ludzkich zarodkowych komórek macierzystych, z trypsyny.

Barwy Pasażowanie ludzkich embrionalnych komórek macierzystych linii Trypsyna

Ten film demonstruje sposób hodowli ludzkich embrionalnych komórek macierzystych (hESCs) na warstwie komórek karmicielskich z embrionalnych fibroblastów mysich (MEF). Część 1 z 3.

Od MEF do Matrigelu I: Pasażowanie hESC w obecności MEF

Niniejszy materiał wideo demonstruje sposób utrzymania wzrostu ludzkich embrionalnych komórek macierzystych (hESCs) w warunkach bez komórek karmących oraz metodę ciągłego pasażowania hESCs w warunkach bez komórek karmących. Przedstawiono również potwierdzenie pluripotencji hESCs hodowanych bez komórek karmących za pomocą mikroskopii immunofluorescencyjnej. Część 2 z 3.

Od MEF do Matrigelu 2: Przesiewanie hESC z MEF na Matrigel

Kierowana różnicowanie hESC w konkretne komórki wzbudziło duże zainteresowanie w medycynie regeneracyjnej. Przedstawiamy zwięzły, szczegółowy protokół służący do określania losów wybranych hESC in vivo, który stanowi cenne narzędzie do charakteryzacji reagentów specyficznych dla tkanek w terapiach komórkowych.

Mapowanie losów ludzkich embrionalnych komórek macierzystych poprzez tworzenie potworniaków

Ten artykuł skupi się na generowaniu ludzkiej endodermy wątrobowej z populacji ludzkich embrionalnych komórek macierzystych.

Solidna generacja komórek podobnych do hepatocytów z ludzkich embrionalnych populacji komórek macierzystych

Jakość embrionalnych fibroblastów mysich (MEFs) zależy od wyboru odpowiedniego szczepu myszy, takiego jak CF-1. MEFs wspierające pluripotencję oraz pożywka warunkowana (CM) uzyskana z tych komórek powinny zawierać optymalne stężenia Activin A, Gremlin oraz Tgfβ1, które są niezbędne do współdziałania szlaków Activin/Nodal i FGF w celu utrzymania samoodnawiania i pluripotencji.

Przygotowanie komórek fibroblastów zarodkowych myszy odpowiednich do hodowli ludzkich embrionalnych i indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych

Pomimo podejmowanych wysiłków w celu przejścia na warunki hodowli bez komórek podporowych, izolacja i hodowla ludzkich embrionalnych komórek macierzystych (hESC) pozostają w dużej mierze zależne od kokultur z embrionalnymi fibroblastami mysimi (MEFs). W niniejszej pracy przedstawiamy nową metodologię szybkiego usuwania komórek podporowych z kultur hESC przed przystąpieniem do eksperymentów.

Szybkie usuwanie fibroblastów z gęstych kultur ludzkich embrionalnych komórek macierzystych

Tutaj opisujemy protokół oparty na epigenetycznym przeprogramowaniu ludzkich embrionalnych komórek macierzystych (hESC) w kierunku generowania jednorodnej populacji komórek progenitorowych mięśni szkieletowych, które w dopuszczalnych warunkach hodowli tworzą trójwymiarowe skupiska kurczliwych włókien mięśniowych (miosfer), które podsumowują biologiczne cechy ludzkich mięśni szkieletowych.

Generowanie miosfer z hESC poprzez przeprogramowanie epigenetyczne

My, opierając się na wiedzy z biologii rozwojowej i opublikowanych badaniach, opracowaliśmy zoptymalizowany protokół do efektywnego generowania neuronów dopaminergicznych A9 śródmózgowia zarówno z ludzkich embrionalnych komórek macierzystych, jak i ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych, co byłoby przydatne do modelowania chorób i terapii zastępczej w chorobie Parkinsona.

Ukierunkowane różnicowanie neuronów dopaminergicznych z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

Tutaj prezentujemy protokół efektywnego generowania ludzkich komórek trofoblastycznych z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych przy użyciu białka morfogennego kości 4 i inhibitorów szlaków aktywinowych/węzłowych. Metoda ta jest odpowiednia do skutecznego różnicowania ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych i może generować duże ilości komórek do manipulacji genetycznej.

In vitro Różnicowanie ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych w komórki trofoblastyczne

Aby uniknąć ograniczeń związanych z enzymatycznym lub mechanicznym pasażowaniem ludzkich embrionalnych komórek macierzystych (hESC) i ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPSC) hodowanych na komórkach żywicielskich, ustaliliśmy szybką, skuteczną, ekonomiczną, wysokowydajną metodę zbierania kolonii hESC lub hiPSC utrzymywanych na warstwie komórek zasilających ludzkie fibroblasty napletka za pomocą dysadhezji za pośrednictwem EDTA.

Szybkie, ekonomiczne, bezenzymatyczne pasażowanie ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych na komórkach zasilających przez dysadhezję za pośrednictwem kwasu etylenodiaminotetraoctowego

Poznaj metodę pasażowania ludzkich komórek macierzystych zarodkowych (hESC) w warunkach bezwarstwy pokarmowej na podłożu Matrigel. Technika obejmuje zastosowanie dispazy, ocenę pluripotencji metodą immunofluorescencji oraz utrzymanie zdrowych kolonii komórkowych.

Od MEF do Matrigelu 3: Pasażowanie hESC z Matrigelu na Matrigel

Przeglądaj więcej filmów