Isolamento de DNA e Análise de Enzimas de Restrição

A extração de DNA é a remoção e purificação do DNA das células. Primeiro, as células são lisadas - abertas - geralmente por meio de uma combinação de ruptura física e tratamento com produtos químicos, como um detergente que dissolve a célula e as membranas nucleares. SDS ou dodecil sulfato de sódio é um detergente comumente usado que funciona solubilizando as proteínas e lipídios que compõem essas membranas. O conteúdo pode então flutuar livremente na solução circundante.

Em seguida, o DNA deve ser separado das outras moléculas presentes. A proteinase K adicionada à reação quebrará as ligações peptídicas e digerirá as proteínas contaminantes. O sal é então adicionado à amostra, o que estabiliza os grupos fosfato carregados negativamente na espinha dorsal do DNA e, após a adição de álcool gelado, precipita o DNA da solução. O precipitado branco é coletado girando-o em uma centrífuga, onde se deposita no fundo do tubo. Depois de lavá-lo e ressuspendê-lo em uma solução tampão, o DNA extraído pode finalmente ser usado em aplicações de pesquisa ou biotecnologia.

Algumas aplicações da biotecnologia, como a impressão digital de DNA, que pode identificar novos padrões no DNA específicos de um indivíduo ou indivíduos, envolvem o uso de enzimas de restrição. As enzimas de restrição são moléculas que interagem com o DNA e reconhecem sequências específicas. Uma vez que seu local específico é identificado, eles cortam o DNA. Isso fará com que o fio seja cortado em um ou mais pedaços lineares. Se o DNA extraído for um plasmídeo, um pedaço circular de DNA mais frequentemente encontrado em bactérias, qualquer corte resultará na formação de um fragmento ou fragmentos lineares do DNA. Diferentes enzimas de restrição reconhecem diferentes sequências de DNA, portanto, o uso de uma combinação delas pode resultar na produção de fragmentos distintos.

Na impressão digital de DNA, podemos examinar esses fragmentos usando uma técnica chamada eletroforese de DNA ou gel. Para preparar géis, a agarose em pó é misturada com um tampão e aquecida até se dissolver. Uma mancha de nucleotídeo é então adicionada à mistura quente e, em seguida, essa solução é despejada no molde de fundição. Um pente é inserido para formar os poços. Quando solidificado, o gel é transferido para uma caixa de gel cheia de tampão e o pente é removido. Uma mistura de referência de fragmentos de DNA tingidos de comprimentos conhecidos, a escada de DNA, é adicionada a um poço e as amostras de DNA tingidas de interesse são carregadas nos poços restantes. A caixa é conectada a uma fonte de energia e ligar a energia induz a migração dos grupos fosfato carregados negativamente nos nucleotídeos de DNA através do gel em direção ao ânodo, a extremidade positiva. Peças menores se movem mais rapidamente do que os fragmentos maiores, que migram com dificuldade.

Quando a execução é concluída, o gel é exposto à luz ultravioleta para visualizar a coloração de nucleotídeos nas amostras de DNA. Sua presença pode ser confirmada com base em sua localização relativa às faixas da escada. Como o DNA com sequências diferentes terá locais de corte em locais diferentes, isso pode produzir novos padrões de bandas, ou impressões digitais, que podem ser usados para distinguir indivíduos ou perfis de DNA variantes.

Neste laboratório, você realizará extrações de DNA usando um tampão com e sem SDS para avaliar a importância dos detergentes no isolamento do DNA e, em seguida, digerir o DNA do plasmídeo com diferentes enzimas de restrição para examinar os perfis de DNA resultantes.