Isolamento de DNA e Análise de Enzimas de Restrição
A revelação do DNA como a molécula hereditária em todos os organismos levou a enormes avanços científicos e médicos e melhorou significativamente noss…
A extração de DNA é a remoção e purificação do DNA das células. Primeiro, as células são lisadas - abertas - geralmente por meio de uma combinação de ruptura física e tratamento com produtos químicos, como um detergente que dissolve a célula e as membranas nucleares. SDS ou dodecil sulfato de sódio é um detergente comumente usado que funciona solubilizando as proteínas e lipídios que compõem essas membranas. O conteúdo pode então flutuar livremente na solução circundante.
Em seguida, o DNA deve ser separado das outras moléculas presentes. A proteinase K adicionada à reação quebrará as ligações peptídicas e digerirá as proteínas contaminantes. O sal é então adicionado à amostra, o que estabiliza os grupos fosfato carregados negativamente na espinha dorsal do DNA e, após a adição de álcool gelado, precipita o DNA da solução. O precipitado branco é coletado girando-o em uma centrífuga, onde se deposita no fundo do tubo. Depois de lavá-lo e ressuspendê-lo em uma solução tampão, o DNA extraído pode finalmente ser usado em aplicações de pesquisa ou biotecnologia.
Algumas aplicações da biotecnologia, como a impressão digital de DNA, que pode identificar novos padrões no DNA específicos de um indivíduo ou indivíduos, envolvem o uso de enzimas de restrição. As enzimas de restrição são moléculas que interagem com o DNA e reconhecem sequências específicas. Uma vez que seu local específico é identificado, eles cortam o DNA. Isso fará com que o fio seja cortado em um ou mais pedaços lineares. Se o DNA extraído for um plasmídeo, um pedaço circular de DNA mais frequentemente encontrado em bactérias, qualquer corte resultará na formação de um fragmento ou fragmentos lineares do DNA. Diferentes enzimas de restrição reconhecem diferentes sequências de DNA, portanto, o uso de uma combinação delas pode resultar na produção de fragmentos distintos.
Na impressão digital de DNA, podemos examinar esses fragmentos usando uma técnica chamada eletroforese de DNA ou gel. Para preparar géis, a agarose em pó é misturada com um tampão e aquecida até se dissolver. Uma mancha de nucleotídeo é então adicionada à mistura quente e, em seguida, essa solução é despejada no molde de fundição. Um pente é inserido para formar os poços. Quando solidificado, o gel é transferido para uma caixa de gel cheia de tampão e o pente é removido. Uma mistura de referência de fragmentos de DNA tingidos de comprimentos conhecidos, a escada de DNA, é adicionada a um poço e as amostras de DNA tingidas de interesse são carregadas nos poços restantes. A caixa é conectada a uma fonte de energia e ligar a energia induz a migração dos grupos fosfato carregados negativamente nos nucleotídeos de DNA através do gel em direção ao ânodo, a extremidade positiva. Peças menores se movem mais rapidamente do que os fragmentos maiores, que migram com dificuldade.
Quando a execução é concluída, o gel é exposto à luz ultravioleta para visualizar a coloração de nucleotídeos nas amostras de DNA. Sua presença pode ser confirmada com base em sua localização relativa às faixas da escada. Como o DNA com sequências diferentes terá locais de corte em locais diferentes, isso pode produzir novos padrões de bandas, ou impressões digitais, que podem ser usados para distinguir indivíduos ou perfis de DNA variantes.
Neste laboratório, você realizará extrações de DNA usando um tampão com e sem SDS para avaliar a importância dos detergentes no isolamento do DNA e, em seguida, digerir o DNA do plasmídeo com diferentes enzimas de restrição para examinar os perfis de DNA resultantes.
A extração de DNA é a remoção e purificação do DNA das células. Primeiro, as células são lisadas - abertas - geralmente por meio de uma combinação de ruptura física e tratamento com produtos químicos, como um detergente que dissolve a célula e as membranas nucleares. SDS ou dodecil sulfato de sódio é um detergente comumente usado que funciona solubilizando as proteínas e lipídios que compõem essas membranas. O conteúdo pode então flutuar livremente na solução circundante.
Em seguida, o DNA deve ser separado das outras moléculas presentes. A proteinase K adicionada à reação quebrará as ligações peptídicas e digerirá as proteínas contaminantes. O sal é então adicionado à amostra, o que estabiliza os grupos fosfato carregados negativamente na espinha dorsal do DNA e, após a adição de álcool gelado, precipita o DNA da solução. O precipitado branco é coletado girando-o em uma centrífuga, onde se deposita no fundo do tubo. Depois de lavá-lo e ressuspendê-lo em uma solução tampão, o DNA extraído pode finalmente ser usado em aplicações de pesquisa ou biotecnologia.
Algumas aplicações da biotecnologia, como a impressão digital de DNA, que pode identificar novos padrões no DNA específicos de um indivíduo ou indivíduos, envolvem o uso de enzimas de restrição. As enzimas de restrição são moléculas que interagem com o DNA e reconhecem sequências específicas. Uma vez que seu local específico é identificado, eles cortam o DNA. Isso fará com que o fio seja cortado em um ou mais pedaços lineares. Se o DNA extraído for um plasmídeo, um pedaço circular de DNA mais frequentemente encontrado em bactérias, qualquer corte resultará na formação de um fragmento ou fragmentos lineares do DNA. Diferentes enzimas de restrição reconhecem diferentes sequências de DNA, portanto, o uso de uma combinação delas pode resultar na produção de fragmentos distintos.
Na impressão digital de DNA, podemos examinar esses fragmentos usando uma técnica chamada eletroforese de DNA ou gel. Para preparar géis, a agarose em pó é misturada com um tampão e aquecida até se dissolver. Uma mancha de nucleotídeo é então adicionada à mistura quente e, em seguida, essa solução é despejada no molde de fundição. Um pente é inserido para formar os poços. Quando solidificado, o gel é transferido para uma caixa de gel cheia de tampão e o pente é removido. Uma mistura de referência de fragmentos de DNA tingidos de comprimentos conhecidos, a escada de DNA, é adicionada a um poço e as amostras de DNA tingidas de interesse são carregadas nos poços restantes. A caixa é conectada a uma fonte de energia e ligar a energia induz a migração dos grupos fosfato carregados negativamente nos nucleotídeos de DNA através do gel em direção ao ânodo, a extremidade positiva. Peças menores se movem mais rapidamente do que os fragmentos maiores, que migram com dificuldade.
Quando a execução é concluída, o gel é exposto à luz ultravioleta para visualizar a coloração de nucleotídeos nas amostras de DNA. Sua presença pode ser confirmada com base em sua localização relativa às faixas da escada. Como o DNA com sequências diferentes terá locais de corte em locais diferentes, isso pode produzir novos padrões de bandas, ou impressões digitais, que podem ser usados para distinguir indivíduos ou perfis de DNA variantes.
Neste laboratório, você realizará extrações de DNA usando um tampão com e sem SDS para avaliar a importância dos detergentes no isolamento do DNA e, em seguida, digerir o DNA do plasmídeo com diferentes enzimas de restrição para examinar os perfis de DNA resultantes.
Q1: Why is SDS used during DNA extraction?
SDS, or sodium dodecyl sulfate, is a detergent that dissolves the lipids and proteins making up cell and nuclear membranes. By solubilizing these membrane components, SDS allows the cell contents, including DNA, to float freely into the surrounding solution, making DNA accessible for further purification steps.
Q2: What role does Proteinase K play in DNA isolation?
Proteinase K is an enzyme that breaks down peptide bonds in proteins, digesting contaminating proteins like histones that bind to DNA. This separation is essential because DNA is tightly condensed around histone proteins inside the nucleus, and removing these proteins allows pure DNA to be recovered.
Q3: How does salt help precipitate DNA from solution?
Salt, typically sodium chloride, stabilizes DNA by allowing Na+ ions to bind to and integrate into the negatively charged phosphate groups in the DNA backbone. This causes DNA strands to clump together, making the precipitate visible and collectible by centrifugation.
Q4: What determines where restriction enzymes cut DNA?
Restriction enzymes recognize and cut DNA at specific nucleotide sequences, typically six to twelve nucleotides long and usually palindromic, meaning they read the same in both the 3'-5' and 5'-3' directions. Different restriction enzymes recognize different sequences, allowing researchers to produce distinct DNA fragments for analysis.
Q5: Why do smaller DNA fragments move faster through gel electrophoresis?
During gel electrophoresis, negatively charged DNA migrates toward the anode through the gel matrix. Smaller DNA fragments navigate the gel's pores more easily than larger fragments, which experience greater resistance and migrate with difficulty, causing size-based separation of DNA pieces.
Q6: How can restriction enzyme digestion create unique DNA fingerprints?
Because different DNA sequences have cut sites at different locations, digesting DNA with restriction enzymes produces novel band patterns specific to each individual's genetic profile. These unique patterns, visualized through gel electrophoresis, can distinguish individuals or variant DNA profiles for forensic and genetic analysis.
Q7: What happens to plasmid DNA when restriction enzymes cut it?
Plasmids are circular DNA molecules commonly found in bacteria. When restriction enzymes cut a plasmid at their recognition sites, the circular DNA becomes linear, forming one or more linear fragments. These fragments can then be isolated and ligated into vectors for bacterial transformation using plasmids procedure applications.