Cromatografia em coluna

Cromatografia em coluna

Existem várias técnicas para purificar e separar compostos em um laboratório de química orgânica. Uma das técnicas de separação mais confiáveis para separações em microescala, onde menos de 10 gramas do composto estão disponíveis para análise, é a cromatografia em coluna. Essa técnica separa os compostos em uma mistura com base em suas propriedades físicas, como solubilidade, polaridade, hidrofobicidade, tamanho e carga.

Noções básicas de cromatografia

Os principais componentes de qualquer sistema de cromatografia são a fase estacionária, a fase móvel e a mistura de amostras a ser analisada. Na cromatografia em coluna, a fase estacionária é tipicamente esferas de microescala, que são embaladas uniformemente em uma coluna vertical. Um fluxo contínuo da fase móvel, também conhecido como solvente, é adicionado ao topo da coluna, que flui através da fase estacionária por gravidade ou a uma taxa de fluxo controlada por uma bomba.

A amostra é dissolvida em uma pequena quantidade do solvente e depois adicionada ao topo da coluna. Mais solvente é adicionado para forçar a amostra a fluir através da fase estacionária. Os compostos na mistura dividem-se entre a fase móvel e a fase estacionária com base em suas propriedades diferentes e formam bandas discretas.

Compostos com fortes interações com a fase estacionária se moverão mais lentamente do que compostos com interações fracas com a fase estacionária. Assim, compostos com interações fracas sairão da coluna, ou eluirão, mais cedo do que aqueles com interações fortes. A força da interação de um composto com a fase estacionária é definida pelo fator de retardo (_{R f}), que é a razão entre a distância percorrida por um componente e a percorrida pela fase móvel. O fator de retardo é determinado pela primeira execução de cromatografia em camada fina.

Um alto valor de fator de retardo indica que a amostra interage fortemente com a fase estacionária e leva muito tempo para eluir. Um baixo valor de fator de retardo indica que a amostra não interage com a fase estacionária com muita força e elui mais rapidamente. Como os compostos se dividem em bandas individuais e eluem da coluna em momentos diferentes devido aos seus diferentes valores de R_f, eles podem ser isolados individualmente coletando o solvente sob a coluna em frações.

Considerações sobre cromatografia em coluna

Uma coluna de cromatografia é um tubo de vidro ou plástico orientado verticalmente. O tamanho da coluna pode variar de alguns centímetros (como uma pipeta Pasteur) a metros (como em colunas industriais). O diâmetro da coluna depende da quantidade de amostra a ser separada, enquanto o comprimento da coluna depende da dificuldade de separação. O particionamento mais eficiente em bandas discretas requer camadas de amostra finas; portanto, determinar o diâmetro apropriado é uma etapa vital. Carregar muito volume de amostra em relação ao diâmetro da coluna criará faixas mais largas e menos definidas do que o mesmo volume de amostra em uma coluna com um diâmetro maior.

Ao escolher o comprimento da coluna, os valores R_f dos componentes devem ser considerados. Componentes com fatores de retardo semelhantes podem ser difíceis de separar e exigir uma coluna mais longa para resolver as bandas individuais. Compostos com fatores de retardo muito diferentes podem não precisar de uma coluna longa, pois devem se particionar facilmente. Ao selecionar a fase estacionária, é importante escolher uma que resulte em diferentes fatores de retardo para cada componente.

Preparar a coluna é a parte mais crítica da execução de uma coluna de cromatografia. A massa da fase estacionária embalada na coluna deve ser pelo menos 20 vezes maior que a da amostra. Se a coluna não tiver um disco poroso na parte inferior, ela deve ser embalada com algodão e uma fina camada de areia. Isso evita a perda da fase estacionária pela saída da coluna.

Existem dois métodos para embalar a coluna: o método de embalagem a seco e o método de pasta. No método seco, a fase estacionária é transferida para a coluna em sua forma de pó. A coluna é então lavada várias vezes com a fase móvel/solvente para garantir que o solvente penetre em todas as partes da coluna de sílica gel. Este método, se não for feito corretamente, pode aumentar a probabilidade de manchas secas, canais e bolhas de ar se formarem na coluna. Esses defeitos afetarão a capacidade da coluna de particionar componentes de uma mistura.

O método de lama fornece uma coluna compactada mais uniforme que não contém bolhas de ar, áreas secas e canais. Para este método, a fase estacionária é misturada com um solvente para formar uma pasta consistente. A pasta é então transferida para a coluna enquanto bate nas laterais para se livrar de quaisquer bolhas de ar formadas. A torneira da coluna, se houver, deve estar aberta durante esta etapa para permitir que o solvente escorra.

Cromatografia de sílica gel

Muitas propriedades diferentes são exploradas para separar uma mistura de compostos, como tamanho, carga e hidrofobicidade. Uma propriedade usada para separar compostos em química orgânica é a polaridade. Para isso, o gel de sílica e o gel de alumina são as fases estacionárias mais comumente utilizadas. O gel de sílica é extremamente polar e forma fortes interações dipolo-dipolo com compostos polares. Além disso, o gel de sílica pode formar ligações de hidrogênio com o analito devido à presença de grupos -OH em sua superfície.

Os componentes da mistura mais polares ligam-se fortemente ao gel de sílica e viajam lentamente pela coluna, enquanto os componentes não polares são mais solúveis na fase móvel e viajam rapidamente pela coluna. Assim, é essencial que os componentes da mistura tenham polaridades diferentes. Os componentes que interagem fortemente com a fase estacionária são eluídos pelo fluxo de uma fase móvel polar através da coluna.

Referências

1. Shuler, M.L., Kargi, K., DeLisa, M. (2017). Engenharia de Bioprocessos, Conceitos Básicos. Rio Saddle Superior, NJ: Prentice Hall.
2. Harris, D.C. (2015). Análise Química Quantitativa. Nova York, NY: W.H. Freeman and Company.

A cromatografia em coluna é uma técnica que usa uma coluna compactada para separar compostos com base em suas interações com uma fase estacionária, que geralmente está na forma de esferas microscópicas. Os espaços entre os grânulos são preenchidos com solvente. A abertura da coluna permite que o solvente flua através da fase estacionária. Quando uma mistura é aplicada no topo da coluna compactada seguida por mais solvente, a mistura se move para a fase móvel e flui através da fase estacionária.

Cada componente da mistura interage com a fase estacionária de uma maneira diferente. Alguns componentes têm interações fracas com a fase estacionária e, portanto, movem-se rapidamente pela coluna, enquanto outros têm fortes interações com a fase estacionária e, portanto, movem-se mais lentamente. Isso separa os diferentes compostos em bandas, que são coletadas em pequenas frações. Isso permite a purificação de cada composto.

Então, que tipo de propriedades podem ser usadas para separar misturas? Uma das propriedades mais comumente usadas é a polaridade. Para isso, o gel de sílica, que é uma forma de dióxido de silício, é frequentemente usado como fase estacionária. O gel de sílica interage com compostos por interações dipolo-dipolo e ligações de hidrogênio através dos grupos -OH que se formam em sua superfície. Assim, os compostos polares interagirão fortemente com a fase estacionária, enquanto os compostos apolares interagirão fracamente.

Outras propriedades que podem ser exploradas para separação incluem tamanho, carga e hidrofobicidade. Uma maneira comum de carregar a fase estacionária na coluna é como uma pasta da fase estacionária e do solvente. Em seguida, a fase estacionária é embalada fluindo mais solvente através da coluna para compactar a pasta. É essencial que a fase estacionária seja embalada uniformemente, sem bolhas de ar, canais vazios ou manchas secas. Isso pode interromper o fluxo e causar a mistura de bandas.

Ao escolher uma coluna, o diâmetro é baseado no volume da amostra a ser separada. A amostra deve cobrir o topo da coluna em uma camada fina e uniforme. Uma camada de amostra mais espessa leva a bandas mais largas. O comprimento da coluna depende de quão bem os compostos se separam na fase estacionária. Compostos com afinidades semelhantes para a fase estacionária requerem uma coluna longa para separação adequada. No entanto, uma mistura de compostos com afinidades muito diferentes para a fase estacionária pode ser separada em uma coluna mais curta.

Neste laboratório, você explorará a cromatografia em coluna primeiro empacotando e preparando uma coluna de sílica gel. Em seguida, você usará sua coluna para separar os componentes coloridos em corante alimentar verde.