Purificação e Visualização de Influenza A complexos de ribonucleoproteínas Viral

Resumo

O genoma do vírus influenza A é composto por oito complexos separada de RNA e proteínas, denominadas complexos de ribonucleoproteínas viral (vRNPs). Este artigo descreve a purificação gradiente glicerol e transmissão de visualização microscopia eletrônica de influenza A vRNPs.

Resumo

A influenza A genoma viral é composto por oito sentido negativo, as moléculas de RNA de fita única, embalados individualmente com várias cópias da influenza A nucleoproteína (NP) em partículas ribonulceoprotein viral (vRNPs). O vRNPs influenza são colocados dentro do envelope viral. Durante a entrada de celulares, no entanto, esses complexos vRNP são liberados para o citoplasma, onde eles ter acesso ao equipamento de transportes anfitrião nuclear. A fim de estudar a importação nuclear de vRNPs influenza ea replicação do genoma da gripe, é útil para trabalhar com vRNPs isolada de modo que outros componentes do vírus não interferem com estes processos. Aqui, descrevemos um procedimento para purificar essas vRNPs do vírus influenza A. O procedimento começa com o rompimento da influenza A virion com detergentes, a fim de liberar os complexos vRNP do virion envolvido. O vRNPs são então separados dos outros componentes da influenza A virion em um gradiente de glicerol 33-70% descontínua por sedimentação velocidade. As frações obtidas a partir do gradiente de glicerol são analisados ​​na via SDS-PAGE após coloração com Coomassie blue. As frações de pico contendo NP são então reunidos e concentrados por centrifugação. Após a concentração, a integridade do vRNPs é verificada através da visualização do vRNPs por microscopia eletrônica de transmissão após coloração negativa. A purificação do gradiente de glicerol é uma modificação do que a partir de Kemler

Protocolo

Parte 1: Rompimento da Influenza A Virion

1. Adicionar 750 mL de tampão MNT (20 mM MES, 150 mM NaCl, 30 mM Tris, pH 7,5) em um tubo de centrífuga Beckman policarbonato (11 mm x 34 mm) projetado para caber em um rotor TLA-120,2 para uso em um Optima Beckman Max-E ultracentrífuga.
2. Adicionar 500 mL do vírus influenza A (H3N2 X-31 A/AICHI/68 tensão; 2 mg / ml) em que o tubo. Misture o vírus com o buffer MNT pipetando cima e para baixo várias vezes.
3. Centrifugar por 10 minutos a 109.000 xg, 4 ° C, em uma centrífuga Beckman Optima Max-E usando um rotor TLA-120,2.
4. Remover o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 500 mL de buffer inte....

Discussão

A purificação da vRNPs é baseado no procedimento descrito por Kemler et al. (1994). ¹ Nós e os outros também têm usado este protocolo para isolar vRNPs para estudar sua importação nuclear. ^2,4,5

Recomendamos o uso de RNase dicas e tubos ao manipular vRNPs porque o genoma viral é composto de RNA, e, portanto, degrada facilmente na presença de RNA. Além disso, todos os buffers deve ser feita em água que é RNase livre. O protocolo aqui descrito foi realizado com u.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
H3N2 X-31 A/AICHI/68 influenza A	Charles River Laboratories	490715
Tris	Sigma-Aldrich	T1503
MES	Sigma-Aldrich	M-8250
Glicerol	Fisher Scientific	G33-1
Octilglicosídeo	Sigma-Aldrich	O-8001
Lisolecitina	Sigma-Aldrich	L-4129
Ditiotretol	Sigma-Aldrich	D-9779
Azul brilhante de Coomassie G-250	Kodak	1367796
Água tratada com pirocarbonato de dietila (DEPC)	Invitrogen	750024
Acetato de uranila	Ted Pella, Inc.	19481
Moilbdata de amônio	Fisher Scientific	A-674
Ultracentrífuga Optima MAX-E	Beckman Coulter Inc.	434491
Pacote de rotor MLS-50, de balde oscilante	Beckman Coulter Inc.	367280
Conjunto de rotor TLA-120.2, de ângulo fixo, em titânio	Beckman Coulter Inc.	362046
Eppendorf Thermomixer	Lauda Brinkmann	022670000