Fluorescência In situ Hybridization (FISH) Protocolo no esperma humano

Resumo

Este vídeo-artigo descreve, passo a passo, como processar uma amostra de sêmen para alcançar boa qualidade de fluorescência In situ Hibridação em espermatozóides humanos. Preparações obtidas podem ser usadas para triagem aneuploidia no contexto do diagnóstico clínico.

Resumo

Aneuploidias são as anormalidades cromossômicas mais freqüentes em humanos. A maioria destas anormalidades resultam de erros durante o processo de meiose gametogénicas nos pais. Nos machos humanos, estes erros podem levar à produção de espermatozóides com anormalidades cromossômicas numéricas que representam um maior risco de transmissão destas anomalias à descendência.

Por esta razão, a técnica de hibridização fluorescente in situ (FISH) em núcleos espermáticos tornou-se um protocolo amplamente incorporada no contexto do diagnóstico clínico. Esta prática fornece uma estimativa das freqüências de anormalidades cromossômicas numéricas nos gametas dos pacientes que procuram para aconselhamento genético reprodutivo.

Até à data, os cromossomos mais freqüentemente incluídos na análise FISH espermatozóides são cromossomos X, Y, 13, 18 e 21.

Este vídeo-artigo descreve, passo a passo, como processar e fixar uma amostra de sêmen humano, como decondense e desnaturar a cromatina de espermatozóides, como proceder para obter preparações FISH esperma, e como visualizar os resultados no microscópio. Observações especiais dos passos mais relevantes são dadas para alcançar os melhores resultados.

Protocolo

I. O processamento da amostra e fixação de células

1. Deixe a amostra de sêmen em recipientes esterilizados em temperatura ambiente por 20 minutos até que a liquefação.
2. Transferir a amostra para um tubo de centrífuga e girá-lo em 1000g por 5 minutos.
3. Remova cuidadosamente e desprezar o sobrenadante com uma pipeta Pasteur.
4. Adicionar solução hipotônica (KCl, 0.075M) pré-aquecido a 37 ° C, gota a gota, ao misturar em um vortex para obter um volume final de 10 ml.
5. Colocar o tubo em banho-maria a 37 ° C por 30 minutos.
6. Centrifugar a 1000g por 5 minutos. Cuidadosamente desprezar o sobrenadante por decantação, sem perturbar o sedimento.
7. Depois de ressuspender o sedimento, adicionar preparados na hora de Carnoy (metanol 03:01: ácido acético) fixador gota a gota, ao misturar em um vortex para obter um volume final de 8 ml.
8. Repetir os pontos 6 e 7 quantas vezes forem necessárias para obter um pó branco.
9. Adicionar metanol preparados na hora: ácido acético (3:1), gota a gota para ajustar o volume final para a concentração celular exigidos para a obtenção de células boa divulgação (nos casos com uma bola pequena, algumas gotas serão suficientes enquanto amostras com uma quantidade elevada de espermatozóides recuperados, o volume final pode chegar a 1-2 ml). A lâmina pode ser feita por deixar cair a amostra ressuspenso em um slide ungreased e examiná-la sob um microscópio de contraste de fase. Isso permitirá verificar a dispersão de celulares obtidos e permitirá corrigi-lo, se for necessário, em slides adicionais.
10. Para fazer com que as extensões, queda de uma altura mínima de 40 cm duas ou três gotas de suspensão de células para o centro de slides unfrosted (anteriormente armazenados em metanol a -20 ° C para as desengordurar). Para possibilitar a localização da amostra durante todo o protocolo, marque a área que contém a extensão de esperma no lado oposto da lâmina utilizando um lápis de diamante.
11. Armazenar os slides a -20 ° C durante pelo menos 24 horas.
    Nota: A adição de metanol: ácido acético (3:1), gota a gota enquanto mistura é um passo muito importante para evitar a formação de agregados de esperma.

II. Descondensação

1. As lâminas armazenadas a -20 ° C devem ser descongelados para continuar com o protocolo (deixá-los em temperatura ambiente).
2. Coloque o slide em dois frascos coplin consecutivos com solução de citrato de sódio 2x solução salina (2xSSC) por 3 minutos cada.
3. Transferir as lâminas através de uma série de lavagens de etanol durante 2 minutos em cada frasco coplin. Comece com etanol 70%, seguido de 90% e terminar com 100%. Secar a lâmina, deixando-o em temperatura ambiente.
4. Incubar as lâminas em solução ditiotreitol (1,4-ditiotreitol 5mM, Triton 1% X-100, 2-Amino-2-(hidroximetil) -1,3-propanodiol 50mm) a 37 ° C na incubadora para decondense a cromatina. Este produto age quebrando as pontes de dissulfeto do protaminas que bobina o DNA no núcleo espermatozóides. Este é um passo muito importante porque o DNA no núcleo de esperma é altamente compactado. O tempo de incubação das lâminas em solução ditiotreitol (TDT) devem ser ajustados de acordo com a reatividade da amostra para este produto. Normalmente, este tempo é de cerca de 8 minutos, embora possa variar de 2 a 15 minutos.
5. Imediatamente, transferir o slide para dois potes consecutivos coplin com 2xSSC por 3 minutos em cada coplin.
6. Continue colocando a lâmina através de uma série de lavagens de etanol durante 2 minutos em cada frasco coplin (70%, 90% e 100% de etanol). Deixe o slide para secar a temperatura ambiente.
   Nota: A exposição excessiva à TDT resultaria em dispersar os sinais de FISH no final do procedimento, enquanto que uma exposição muito curto resultaria em uma falta de alguns sinais.

III. Hibridização

1. Desnaturar o DNA do esperma, incubando o slide em um frasco com solução de formamida coplin (70% Formamide/2xSSC) a 73 ° C por 5 minutos.
2. Transferir as lâminas através de soluções de etanol para 1 minuto por coplin jar (começar com etanol 70%, 85% e terminar com 100%). Deixe o slide para secar a temperatura ambiente.
3. Adicionar diretamente l 5 do correspondente ready-to-use a mistura para uma sonda lamínula 15x15 (Painel Probe Assay AneuVysion Multi-color: CEP 18/X/Y ou LSI 13/21).
4. Como é mostrado no vídeo, coloque cuidadosamente o slide sobre a lamínula para unir a região-alvo e da mistura da sonda. Selá-lo com cimento de borracha.
5. Coloque o slide em uma pré-aquecido 37 ° C câmara de hibridação (HYBrite ™) e incubar-lo a 37 ° C por 24/06 horas.
   Nota: Considerando que a desnaturação da amostra de esperma é obrigatória, a necessidade de desnaturação das sondas é determinado pelo fabricante. As misturas sondas utilizadas neste protocolo está pronto para usar e, neste caso, desnaturação da sonda não é necessária.
   O volume da mistura sonda irá variar de acordo com o tamanho da área hibridizada.

IV. Lavagenspós-hibridização

1. Retire a lâmina da câmara de hibridização.
2. Remover o cimento de borracha e com cuidado retire a lamínula de correr suavemente para o lado.
3. Para eliminar os sinais de hibridação inespecífica lugar do slide por 2 minutos em uma jarra com coplin 0.4xSSC/0.3% NP-40 pré-aquecido a 73 ° C em banho-maria.
4. Transferir as lâminas para uma solução 2xSSC/0.1% NP-40 lavar em temperatura ambiente por 1 minuto. Deixe o slide para secar a temperatura ambiente.
5. Adicionar um produto de contraste para a região de destino (8 l para uma lamínula 18x18). O produto mais utilizado é de 4 ',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, Vysis Inc.).
6. Como é mostrado no vídeo, cobrir a região hibridizada com uma lamínula (para preservar a hibridização da lamínula pode ser selada com verniz das unhas).
7. Loja slides hybridized a -20 ° C no escuro até a sua análise perspectiva. Sob essas condições os slides podem ser armazenadas por até 12 meses sem perda significativa da intensidade do sinal de fluorescência.
   Nota: A temperatura mais alta ou um tempo de lavagem excessiva pode resultar na eliminação de alguns sinais, enquanto o oposto não lavar a sonda hibridizações inespecíficas.
   O volume do produto adicionado contracoloração irá variar de acordo com o tamanho da área de hibridação para cobrir.

Visualization V.

As preparações podem ser avaliados sob um microscópio de epifluorescência equipado com um filtro de banda tripla para DAPI / Texas Red / FITC e única banda de filtros para Aqua, FITC e Red Texas. Critérios de avaliação padrão devem ser seguidas para a correta avaliação dos núcleos de esperma ^1.

A preparação hibridizado com sondas para os cromossomos X, Y e 18 devem mostrar sinais para estes três cromossomos. Todos os espermatozóides normais deve mostrar um sinal azul (correspondente ao cromossomo 18), e um sinal verde (X-rolamento espermatozóides) ou um sinal vermelho (Y-rolamento espermatozóides).

Na preparação hibridizado com sondas para os cromossomos 13 e 21, um sinal verde para o cromossomo 13 e um sinal vermelho para o cromossomo 21 deve ser diferenciado em todos os espermatozóides normais.

Discussão

Este protocolo descreve como processar amostras de sêmen humano para a obtenção de preparações FISH esperma. Usando este protocolo, é possível analisar anormalidades cromossômicas em gametas masculinos. Espermatozóides triagem aneuploidia tem aplicações tanto no contexto da pesquisa básica e no aconselhamento reprodutivo dado a homens inférteis. Embora no diagnóstico clínico dos cromossomos mais estudados são X, Y, 13, 18 e 21, outras sondas comerciais para uma vasta gama de cromossomos e loci estão disponíveis e também...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
1,4-Ditiotreitol (DTT)	Material	Grupo Roche	10197777001
2-Amino-2-(hidroximetil)-1,3-propanodiol	Material	Grupo Roche	10708976001
Ácido acético	Material	Merck && Cia., Inc.	100.063
AneuVysion® Kit Multicolor de Sonda de DNA 20x Salina-Citrato de Sódio 4,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI II) Sonda de DNA CEP 18/X/Y NP-40 Sonda de DNA LSI 13/21	Material	Vysis Inc.	32-161075 30-805850 30-804941 30-171077 30-804820 30-171078
Centrífuga 5804R	Ferramenta	Eppendorf
Tubo de centrífuga	Material	Nalge Nunc international	347856
frasco Coplin (vidro)	Material	Barloworld Scientific	Hellendahl (ZCT278)
frasco Coplin (plástico)	Material	Deltalab	191087
Lâminas de cobertura (15x15)	Material	Knittel Glaser	4600115
Lâminas de cobertura (18x18)	Material	Knittel Glaser	4600118
Lápis de diamante	Material	Hammacher	335117010
Etanol	Material	Merck && Cia., Inc.	100.983
Formamida	Material	Grupo Roche	11814320001
Freezer	Ferramenta	Zanussi
Luvas	Material	Sanyo	101/3300
HYBrite™	Ferramenta	Vysis Inc.
Óleo de imersão	Material	Olympus Corporation	35505
Incubadora	Ferramenta	Heraeus Instruments
Metanol	Material	Merck && Cia., Inc.	106.009
Micropipeta	Material	Labsystems	Finnpipette (4500000)
Ponteira de reposição para micropipeta	Material	Daslab	16-2001
Esmalte de unha	Material	Quo-cosméticos
Microscópio epifluorescente Olympus BX60	Ferramenta	Olympus Corporation		Equipado com filtro triplo para DAPI/Texas Red/FITC e filtros monocromáticos para Aqua, FITC e Texas Red.
Pipeta de Pasteur	Material	Rubilabor	211.0230
Microscópio de contraste de fase	Ferramenta	Nikon Instruments
Pipeta plástica (3 ml)	Material	Deltalab	200007
Cloreto de potássio (KCl)	Material	Fluka	60128
Cimento de borracha	Material	Melhor teste
Lâminas	Material	Knittel Glaser	4520022
Caixas Protetoras para Lâminas	Material	Deltalab	19276.1
Recipiente estéril	Material	Deltalab	409726
Seringa	Material	PentaFerte	002022300
Termômetro	Material	Comark Instruments, Inc	KM12
Água tri-destilada	Material
Triton X-100	Material	Sigma-Aldrich	9002-93-1
Pinça	Material	B. Braun Medical	Aesculap (BD224R)
Laminar vertical capela de fluxo	Ferramenta	Burdinola	OR-ST 1500
Misturador de vórtice	Ferramenta	Fisher Scientific	FB15012
Banho-maria	Ferramenta	Raypa®