Artigo de método
Este vídeo-artigo descreve, passo a passo, como processar uma amostra de sêmen para alcançar boa qualidade de fluorescência In situ Hibridação em espermatozóides humanos. Preparações obtidas podem ser usadas para triagem aneuploidia no contexto do diagnóstico clínico.
Aneuploidias são as anormalidades cromossômicas mais freqüentes em humanos. A maioria destas anormalidades resultam de erros durante o processo de meiose gametogénicas nos pais. Nos machos humanos, estes erros podem levar à produção de espermatozóides com anormalidades cromossômicas numéricas que representam um maior risco de transmissão destas anomalias à descendência.
Por esta razão, a técnica de hibridização fluorescente in situ (FISH) em núcleos espermáticos tornou-se um protocolo amplamente incorporada no contexto do diagnóstico clínico. Esta prática fornece uma estimativa das freqüências de anormalidades cromossômicas numéricas nos gametas dos pacientes que procuram para aconselhamento genético reprodutivo.
Até à data, os cromossomos mais freqüentemente incluídos na análise FISH espermatozóides são cromossomos X, Y, 13, 18 e 21.
Este vídeo-artigo descreve, passo a passo, como processar e fixar uma amostra de sêmen humano, como decondense e desnaturar a cromatina de espermatozóides, como proceder para obter preparações FISH esperma, e como visualizar os resultados no microscópio. Observações especiais dos passos mais relevantes são dadas para alcançar os melhores resultados.
I. O processamento da amostra e fixação de células
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Este protocolo descreve como processar amostras de sêmen humano para a obtenção de preparações FISH esperma. Usando este protocolo, é possível analisar anormalidades cromossômicas em gametas masculinos. Espermatozóides triagem aneuploidia tem aplicações tanto no contexto da pesquisa básica e no aconselhamento reprodutivo dado a homens inférteis. Embora no diagnóstico clínico dos cromossomos mais estudados são X, Y, 13, 18 e 21, outras sondas comerciais para uma vasta gama de cromossomos e loci estão disponíveis e também.......
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Os autores não têm nada a declarar.
Este trabalho foi financiado pela Generalitat de Catalunya (2005-SGR00437). Os autores agradecem a J. Blanco e F. Vidal para a sua supervisão e encorajamento, e Lucas J. para a sua assistência técnica.
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| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários | |
|---|---|---|---|---|
| 1,4-Ditiotreitol (DTT) | Material | Grupo Roche | 10197777001 | |
| 2-Amino-2-(hidroximetil)-1,3-propanodiol | Material | Grupo Roche | 10708976001 | |
| Ácido acético | Material | Merck && Cia., Inc. | 100.063 | |
AneuVysion® Kit Multicolor de Sonda de DNA
| Material | Vysis Inc. | 32-161075
| |
| Centrífuga 5804R | Ferramenta | Eppendorf | ||
| Tubo de centrífuga | Material | Nalge Nunc international | 347856 | |
| frasco Coplin (vidro) | Material | Barloworld Scientific | Hellendahl (ZCT278) | |
| frasco Coplin (plástico) | Material | Deltalab | 191087 | |
| Lâminas de cobertura (15x15) | Material | Knittel Glaser | 4600115 | |
| Lâminas de cobertura (18x18) | Material | Knittel Glaser | 4600118 | |
| Lápis de diamante | Material | Hammacher | 335117010 | |
| Etanol | Material | Merck && Cia., Inc. | 100.983 | |
| Formamida | Material | Grupo Roche | 11814320001 | |
| Freezer | Ferramenta | Zanussi | ||
| Luvas | Material | Sanyo | 101/3300 | |
| HYBrite™ | Ferramenta | Vysis Inc. | ||
| Óleo de imersão | Material | Olympus Corporation | 35505 | |
| Incubadora | Ferramenta | Heraeus Instruments | ||
| Metanol | Material | Merck && Cia., Inc. | 106.009 | |
| Micropipeta | Material | Labsystems | Finnpipette (4500000) | |
| Ponteira de reposição para micropipeta | Material | Daslab | 16-2001 | |
| Esmalte de unha | Material | Quo-cosméticos | ||
| Microscópio epifluorescente Olympus BX60 | Ferramenta | Olympus Corporation | Equipado com filtro triplo para DAPI/Texas Red/FITC e filtros monocromáticos para Aqua, FITC e Texas Red. | |
| Pipeta de Pasteur | Material | Rubilabor | 211.0230 | |
| Microscópio de contraste de fase | Ferramenta | Nikon Instruments | ||
| Pipeta plástica (3 ml) | Material | Deltalab | 200007 | |
| Cloreto de potássio (KCl) | Material | Fluka | 60128 | |
| Cimento de borracha | Material | Melhor teste | ||
| Lâminas | Material | Knittel Glaser | 4520022 | |
| Caixas Protetoras para Lâminas | Material | Deltalab | 19276.1 | |
| Recipiente estéril | Material | Deltalab | 409726 | |
| Seringa | Material | PentaFerte | 002022300 | |
| Termômetro | Material | Comark Instruments, Inc | KM12 | |
| Água tri-destilada | Material | |||
| Triton X-100 | Material | Sigma-Aldrich | 9002-93-1 | |
| Pinça | Material | B. Braun Medical | Aesculap (BD224R) | |
| Laminar vertical capela de fluxo | Ferramenta | Burdinola | OR-ST 1500 | |
| Misturador de vórtice | Ferramenta | Fisher Scientific | FB15012 | |
| Banho-maria | Ferramenta | Raypa® |
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