Um sistema simples de pontuação Composite Fenótipo para avaliar modelos de ratos de ataxia cerebelar

Summary

Nós descrevemos um protocolo para a quantificação rápida e sensível da gravidade da doença em ratos de ataxia cerebelar. Medidas incluem membro posterior segurando, borda teste de marcha, e cifose. Este protocolo efetivamente discrimina entre os indivíduos afetados e não afetados, e detecta a progressão dos indivíduos afetados ao longo do tempo.

Abstract

Nós descrevemos um protocolo para a quantificação rápida e sensível da gravidade da doença em ratos de cerebelos ataxia. É derivado do fenótipo avaliações anteriormente publicados em diversos modelos de doenças, incluindo ataxias espinocerebelares, a doença de Huntington s e atrofia muscular spinobulbar. Medidas incluem membro posterior segurando, borda teste de marcha, e cifose. Cada medida é registrada em uma escala de 0-3, com um total combinado de 0-12 para todas as quatro medidas. Os resultados efetivamente discriminar entre indivíduos afetados e não afetados, ao mesmo tempo, quantificar a progressão temporal de fenótipos da doença neurodegenerativa. Medidas podem ser analisados ​​individualmente ou combinadas em uma pontuação fenótipo composto de maior poder estatístico. A combinação ideal das quatro medidas descritas dependerá do distúrbio em questão. Nós apresentamos um exemplo do protocolo utilizado para avaliar a gravidade da doença em um modelo de camundongo transgênico do tipo ataxia espinocerebelar 7 (SCA7).

Albert R. La Spada e Gwenn A. Jardim contribuíram para este manuscrito de forma igual.

Protocol

Para evitar viés, o experimentador realizar as avaliações não devem ter conhecimento do genótipo do animal. Medidas individuais são pontuados em uma escala de 0-3, com 0 representando uma ausência do fenótipo relevantes e 3 representa a manifestação mais grave. Cada teste é realizado várias vezes para garantir que a pontuação é reproduzível. A obesidade vai complicar a interpretação de todas as medidas descritas. O investigador pode querer pesar camundongos após marcar fenótipo para avaliar o possível papel de adiposidade nos resultados.

Teste Ledge

O teste de borda é uma medida direta da coordenação, que é prejudicada em ataxias cerebelar e muitas outras doenças neurodegenerativas. Esta medida é a mais diretamente comparáveis ​​aos sinais humanos de ataxia cerebelar.

1. Levante o mouse da gaiola e coloque-a borda da gaiola. Camundongos normalmente caminhar ao longo da borda e tentativa de descer de volta na gaiola.
2. Observe o mouse como ele anda ao longo da borda da gaiola e reduz-se em sua gaiola. Um rato do tipo selvagem, normalmente a pé ao longo da borda, sem perder o seu equilíbrio, e irá reduzir-se de volta para a jaula graciosamente, usando suas patas. Este é atribuída uma pontuação de 0. Se o mouse perde o seu pé durante a caminhada ao longo da borda, mas por outro lado aparece coordenada, ele recebe uma pontuação de 1. Se não usar eficazmente as patas traseiras, ou terras em sua cabeça ao invés de suas patas ao descer na gaiola, ele recebe uma pontuação de 2. Se ela cair fora da borda, ou quase isso, durante a caminhada ou a tentativa de menores em si, ou shakes e se recusa a mover-se a todos, apesar de encorajamento, que recebe uma pontuação de 3. Alguns mouses exigirá um pequeno empurrão para incentivá-los a caminhar ao longo da borda ou descer na gaiola.
3. Registre o resultado do teste borda.

Hindlimb clasping

Hindlimb clasping é um marcador de progressão da doença em uma série de modelos de mouse da neurodegeneração, incluindo certas ataxias cerebelar [1].

1. Segure a cauda perto de sua base e levante o mouse clara de todos os objectos que nos rodeiam.
2. Observe a posição dos membros posteriores por 10 segundos. Se a membros posteriores são consistentemente splayed para fora, longe do abdômen, é atribuída uma pontuação de 0. Se um membro posterior é retraída em direção ao abdômen há mais de 50% do tempo suspenso, ele recebe uma pontuação de 1. Se ambos os membros posteriores são parcialmente retraída em direção ao abdômen há mais de 50% do tempo suspenso, ele recebe uma pontuação de 2. Se a sua hindlimbs são totalmente retraída e tocar no abdômen há mais de 50% do tempo suspenso, ele recebe uma pontuação de 3.
3. Posicione o mouse de volta para sua gaiola e registrar sua pontuação hindlimb apertando.

Marcha

Marcha é uma medida de coordenação e função muscular.

1. Retire o mouse de sua gaiola e coloque-o sobre uma superfície plana com a cabeça virada para o investigador.
2. Observe o mouse por trás como ele anda. Se o mouse se move normalmente, com o seu peso corporal compatível com todos os membros, com o seu abdômen não tocar o chão, e com ambos os membros posteriores participantes uniformemente, ele recebe uma pontuação de 0. Se ele mostra um tremor ou aparece a coxear durante a caminhada, ele recebe uma pontuação de 1. Se ele mostra um tremor grave, limp grave, baixou pélvis, ou os pés ponto longe do corpo durante a locomoção ("pés de pato"), ele recebe uma pontuação de 2. Se o mouse tem dificuldade em avançar e arrasta o seu abdome ao longo do chão, ele recebe uma pontuação de 3.
3. Posicione o mouse de volta para sua gaiola e registrar sua pontuação da marcha.

Cifose

Cifose é uma curvatura característica dorsal da coluna vertebral que é uma manifestação comum de doenças neurodegenerativas em modelos de ratos [2]. É causada por uma perda de tônus ​​muscular nos músculos da coluna vertebral secundária à neurodegeneração.

1. Retire o mouse de sua gaiola e coloque-o sobre uma superfície plana.
2. Observe como ele anda. Se o mouse é capaz de facilmente acertar a sua espinha como ele anda, e não tem cifose persistente, que recebe uma pontuação de 0. Se o mouse apresenta cifose leve, mas é capaz de acertar a sua coluna vertebral, que recebe uma pontuação de 1. Se ele é incapaz de acertar a sua espinha completamente e mantém cifose, mas persistente leve, ele recebe uma pontuação de 2. Se o mouse mantém cifose pronunciada como caminhadas ou enquanto ele se senta, ela é atribuída uma pontuação de 3.
3. Posicione o mouse de volta para sua gaiola e registrar sua pontuação cifose.

Resultados representativos

Com um número suficiente de animais, este procedimento é capaz de detectar diferenças entre as linhagens fenótipo e dentro da mesma estirpe ao longo do tempo. Para análise dos dados, calcular a pontuação para cada medida, tendo amédia das três medidas em cada indivíduo. Medidas podem ser analisadas separadamente ou combinadas em uma pontuação fenótipo composto para cada indivíduo.

Gráfico os dados e aplicar os métodos estatísticos adequados para determinar a significância. A Figura 1 mostra os resultados de uma avaliação fenótipo composto de um modelo murino SCA7 transgênicos. Neste modelo floxed-SCA7 92Q-transgênico, o gene da ataxina-7 humana com 92 repetições CAG é ladeado por sites loxP e expressa a partir de um cromossomo bacteriano artificial. A pontuação fenótipo composto inclui a clasping, andando borda da marcha e avaliações cifose para uma pontuação máxima possível de 12. O fenótipo SCA7 progressiva nos ratos floxed-SCA7-92Q transgênicos é demonstrada por um aumento da pontuação fenótipo composto, que é consistente com a natureza progressiva da doença humana.

. Figura 1 Floxed-SCA7-92Q ratos exibem um fenótipo SCA7 progressiva que é significativamente diferente do não-transgênico littermates início em 20 semanas (2-way ANOVA: Bonferroni post-hoc; *** P <0,001). Camundongos foram avaliados em uma escala de 0-3 para cada teste borda, apertando, marcha, e cifose. Escore composto média para cada genótipo em cada idade foi calculada. Barras representam SEM.

Discussion

Este protocolo é projetado para ser uma avaliação sensível e de fácil realização da gravidade da doença em ratos de ataxia cerebelar. Componentes individuais do sistema de pontuação será mais ou menos eficaz em modelos de ratos diferentes de neurodegeneração.

Elementos deste sistema de pontuação foram efetivamente utilizados para avaliar uma variedade de modelos do rato da doença neurodegenerativa humanos, incluindo ataxias cerebelar, doença de Huntington s e atrofia muscular spinobulbar [1-...