Decifrando Pathways Axonal dos Grupos geneticamente definidos de neurônios no tubo Neural Utilizando Pintainho In ovo Eletroporação

Summary

Este vídeo demonstra como visualizar caminhos axonal de grupos geneticamente definido de neurônios na medula espinhal utilizando pinto embrionárias In ovo Eletroporação de genes repórter sob o controle de elementos específicos enhancer.

Abstract

Emprego de elementos enhancer para dirigir a expressão de genes repórter em neurônios é um paradigma amplamente utilizado para rastreamento de projeção axonal. Para rastreamento de projeção axonal de interneurônios da coluna vertebral nos vertebrados, os genes de células germinativas alvo repórter rendimento rotulagem bilateralmente simétrica. Portanto, é difícil distinguir entre o ipsi-e contra-lateralmente axônios de projeção. Eletroporação unilateral dentro do tubo neural pinto fornece um meio útil para restringir a expressão de um gene repórter para um lado do sistema nervoso central, e seguir a projeção axonal em ambos os lados

Protocol

I. Eletroporação

Manipulação de ovos

1. Coloque os ovos em um conjunto de incubadora umidificada a 37-38 ° C, de preferência uma incubadora com um bandejas de balanço.
2. Embrião são electroporated após cerca de 66 horas de incubação, quando atingiram Hamburger & Hamilton estágio (HH) 18-20. Nesta fase, a cabeça encontra-se em ângulos retos com o tronco (condição chamada de flexão cervical) e um vasto conjunto de vasos extra-embrionárias do sangue, como o anterior, posterior, direita e esquerda veias vitelina deve ser visto. Esta é uma fase ótima para enhancer-dependente expressão específica ^1,3,4. É importante monitorar a temperatura e umidade da incubadora, a fim de obter embriões viáveis ​​e sincronizados.
3. Após 66 horas de incubação, retirar os ovos da incubadora. Coloque os ovos na horizontal. Espere 5-10 minutos. O embrião agora está localizada no pólo superior do ovo.

Preparativos

1. Preparar a solução de Hank com penicilina estreptomicina / (P / S) (1:100).
2. Puxe capilares de vidro (0,5 mm de diâmetro) para microcapilar.
3. Coloque os eletrodos (tungstênio) em micromanipulador e conectar eletrodos ao gerador de pulsos (ECM 830).
4. Ajustar o gerador de pulsos com os seguintes parâmetros: 30V de tensão, número de pulsos - 3, comprimento do pulso de 50 ms.
5. Prepare uma pipeta na boca, uma agulha de seringa e uma fita.
6. Prepare uma mistura de DNA desejado (2-5μg/μl) e adicionar um corante Fast Green.

Janelas e eletroporação

1. Usando uma seringa, remova 5-6 ml de albumina de cada ovo.
2. Com uma tesoura pequena e aberta uma janela oval na parte superior do ovo.
3. Embrião úmido com 0,5-1ml de Hank + solução de P / S.
4. Use uma pipeta de boca, para carregar o vidro microcapilar com a mistura de DNA.
5. Coloque o embrião com sua cauda em sua direção. Nesta fase, a medula espinhal de embriões é claramente visto. Assim, não técnicas de contraste são necessários. A medula espinhal é selado em ambas as extremidades, a cabeça ea cauda, ​​mas se o seu microcapilar é fina o suficiente, você será capaz de furar um buraco pequeno e penetrar no tubo neural em um ângulo raso. A microcapilar de diâmetro direito deve ser carregado facilmente com DNA, penetrar no tubo sem danificá-lo e liberar o DNA com uma exalação regular.
6. Injetar o DNA com uma pipeta de boca. O corante verde deve se espalhar a partir da ponta da cauda até as vesículas do cérebro em desenvolvimento.
7. Colocar os eletrodos em paralelo ao tubo neural, tão perto quanto você pode, sem tocar o próprio tubo e pulso. No momento do pulso, os eletrodos devem ser cobertos com o líquido para permitir condutividade elétrica. Normalmente, a quantidade de Hank é adicionado na mendicidade é suficiente. Se não adicionar uma gota de apenas de Hank antes do pulso.
8. Remova cuidadosamente os eletrodos e selar a janela com uma fita. É importante para selar o ovo inteiramente para evitar a secagem do embrião durante o período de incubação seguinte.
9. Coloque o ovo de volta na incubadora.

II. Preparação medula espinhal livro aberto

Descolamento da medula espinhal do embrião

1. Remover o embrião eletroporated, em E6, do ovo e coloque-o em um prato de Petri revestidas com silicone contendo PBS.
2. Cortar as membranas e esticar o embrião do seu lado ventral utilizando pinos para prendê-lo.
3. Usando um tungstênio afiadas microcapilar fazer uma incisão longitudinal ao longo da placa do telhado, do rombencéfalo até a cauda.
4. Faça um adicional de duas incisões longitudinais em ambos os lados da medula espinhal, destacando-se os gânglios da raiz dorsal (DRGs) de distância da medula espinhal.
5. Destacar a placa de fundo a partir do tecido a partir da cauda para o rombencéfalo, deixando a medula espinhal intacta.
6. Corte da medula espinhal em uma seção transversal na parte posterior do cérebro usando uma tesoura fina e separá-lo do corpo.

Fixação

1. Espalhe o cordão espinhal isolado numa placa de Petri novo revestido com silicone contendo PBS, utilizando os pinos para prendê-lo, a partir do cérebro posterior à cauda produzir uma preparação flat-mount.
2. Despeje o PBS do prato e substituí-lo com paraformaldeído 4% em tampão fosfato.
3. Incubar a temperatura ambiente por 1 hora.

Imuno-histoquímica

1. Transferir o cabo fixo da coluna vertebral em um frasco contendo anticorpo primário em PBS.
2. Incube com agitações suave durante a noite a 4 ° C.
3. Lavar o anticorpo X5 vezes com PBS, cada lavagem durante 1 hora com agitação suave.
4. Adicionar anticorpo secundário e incubar com agitações suave durante a noite a 4 ° C.
5. Lavar o anticorpo X5 vezes com PBS, cadalavar por 1 hora com agitação suave.

Montagem de livro aberto para imagens

1. Esfregaço graxa ou silicone em forma de retângulo sobre uma lâmina e gotejar PBS dentro.
2. Coloque a medula espinhal esticada no meio do retângulo, usando uma pinça e extrair o líquido em torno dele com uma pipeta Pasteur.
3. Coloque 1-2 gotas de meios de montagem sobre a medula espinhal e cobrir com lamínula. Esmagá-lo para evitar bolhas de ar.
4. Manter os slides no escuro em 4 ° C.
5. Inspecionar a medula espinhal através de microscopia confocal.

Discussion

Eletroporação de DNA plasmídeo no embrião de galinha evolui como uma poderosa técnica para na expressão ectópica vivo. A combinação de enhancers específico, e eletroporação pinto fornece uma ferramenta rápida e eficiente para decifrar caminhos axonal de um grupo geneticamente definido de neurônios ^1,3,5. Utilizando o Cre / LoxP e os sistemas de amplificação Gal4/UAS pode aumentar a intensidade e duração da expressão. A imagem que surge é de uma divergência complexo de pistas axonal que surge a partir subpopul...