Laser Microdissection Toegepast op gen expressie profilering van de subset van cellen uit de Drosophila Wing Disc

Summary

Laser microdissection werd toegepast op de gen expressie profilering te analyseren in specifieke compartimenten van Drosophila vleugel schijf onderworpen aan een gelokaliseerde RNAi

Abstract

Heterogene karakter van de weefsels heeft zich bewezen als een beperkende factor zijn in de hoeveelheid informatie die kan worden gegenereerd op basis van biologische monsters, ten koste gaat stroomafwaarts analyses. Gezien de complexe en dynamische cellulaire verenigingen bestaande in vele weefsels, om de in-vivo-interacties diepgaande moleculaire analyse samenvatten men moet in staat zijn om specifieke celpopulaties te analyseren in hun oorspronkelijke context. Laser-gemedieerde microdissectie kan dit doel te bereiken, waardoor ondubbelzinnige identificatie en succesvolle oogst van cellen van belang in de directe microscopische visualisatie met behoud van moleculaire integriteit. We hebben paste deze technologie om de genexpressie te analyseren in bepaalde gebieden van de ontwikkeling van Drosophila vleugel schijf, die een voordelig modelsysteem om de groei controleren, celdifferentiatie en organogenese studie vertegenwoordigt. Larvale verbeelding schijven zijn vroegtijdig onderverdeeld in voorste en achterste, dorsale en ventrale compartimenten door afkomst beperking grenzen. Door gebruik te maken van het induceerbare GAL4-UAS binaire expressie systeem, elk van deze compartimenten kunnen specifiek worden geëtiketteerd in transgene vliegen hebben een UAS-GFP transgene onder de controle van de juiste GAL4-driver te construeren. In de transgene schijven, kan de genexpressie profilering van discrete subsets van cellen nauwkeurig kan worden bepaald na de laser-gemedieerde microdissection, met behulp van de TL-GFP signaal naar laser gesneden gids.

Onder de variëteit van downstream-toepassingen, hebben we ons gericht op de RNA-transcript profilering na gelokaliseerde RNA-interferentie (RNAi). Met de komst van RNAi-technologie, kan de etikettering GFP gekoppeld worden met gelokaliseerde knockdown van een bepaald gen, het mogelijk maakt om de transcriptionele respons van een discrete celpopulatie aan de specifieke gen-silencing bepaald. Om deze aanpak te valideren, we ontleed gelijkwaardige gebieden van de schijf van de achterste (gelabeld door GFP expressie), en de voorste (ongelabelde) compartiment op het regionale zwijgen op te leggen in de P-compartiment van een alom anders uitgedrukt gen. RNA werd geëxtraheerd uit gemicrodissecteerde zwijgen opgelegd en unsilenced gebieden en vergelijkende gen expressie profilering bepaald door kwantitatieve real-time RT-PCR. We laten zien dat deze methode effectief kan worden toegepast voor nauwkeurige transcriptomics van subsets van cellen in het Drosophila imaginaire schijven. Sterker nog, terwijl de grote schijf voorbereiding als bron van RNA over het algemeen veronderstelt cel homogeniteit, is het algemeen bekend dat transcriptionele expressie sterk kan variëren binnen deze structuren ten gevolge van positionele informatie. Met behulp van gelokaliseerde fluorescerende GFP signaal naar laser gesneden gids, kunnen meer accurate transcriptie analyses worden uitgevoerd en winstgevend toegepast op uiteenlopende toepassingen, waaronder transcript profilering van verschillende cellijnen in hun oorspronkelijke context.

Protocol

Deel 1. De voorbereiding van Drosophila imaginaire Wing Discs onderworpen aan specifieke en lokale RNAi.

Als biologisch materiaal, gebruikten we Drosophila verbeelding vleugels schijven verkregen uit transgene larven onderworpen aan de lokale en specifieke gene silencing door middel van het GAL4/UAS systeem ^1. Deze larven nageslacht orginates van een genetische kruising waarbij twee ouders lijnen: een uitvoering van de GAL4 bestuurder, de tweede de UAS responder. In aanvulling op GAL4 uit te drukken in een bepaalde temporele en / of ruimtelijke patroon, de bestuurder lijn draagt ​​een UAS-GFP reporter die het mogelijk maakt te visualiseren van de GAL4 uitdrukking domein. De UAS responder lijn uitdrukt, onder de controle van de UAS-sequentie, een hairpin zwijgen RNA (hpRNA) in staat om specifiek op de geselecteerde gen van belang (noem het gen X) ^2. Eenmaal uitgedrukt in de cel, wordt het hpRNA X gesplitst in kleine interfererende RNA (siRNA) in staat om specifiek geluid van de geselecteerde gen te genereren. In het larvale nageslacht, dat draagt ​​zowel de bestuurder en responder transgenen, de UAS-silencing bouwen alleen is getranscribeerd in die cellen die de GAL4 eiwit, en is dus in staat om een ​​ruimtelijk beperkte zwijgen van de geselecteerde genen te induceren X.

Onder de verscheidenheid van mogelijke toepassingen, passen we deze benadering van een geselecteerd gen van ons belang (gen X) onder de controle van de engrailed-GAL4 (nl) driver, welke specifieke zwijgen kan leiden in het achterste compartiment van de vleugel schijf ³ stilte , was het grondgebied waarvan gekenmerkt door de expressie van het UAS-GFP transgen.

Het zwijgen verbeelding vleugel schijven werden met de hand ontleed, en zorg ervoor dat omliggende vervuilende weefsels, met name het vasthouden luchtpijpen te elimineren. Elke geïsoleerde vleugel schijf werd vervolgens snel en voorzichtig overgebracht naar een eerder behandeld, RNase vrij dissectie frame voor onmiddellijke laser microdissectie van de geselecteerde gebieden.

Deel 2. Laser microdissectie van geselecteerde gebieden van het zwijgen (posterior) en unsilenced (anterior) compartimenten van de vleugel schijf.

Nadat de vleugel disc is op het membraan, laser microdissectie van specifieke gebieden van zwijgen (posterior, GFP-label) en unsilenced (anterior, GFP-niet gemerkt) compartimenten werd bereikt. Dit werd uitgevoerd door het tekenen van een gebied dat makkelijk zou kunnen passen bij beide is de GFP-positieve en GFP-negatieve kanten van de schijf. Onder de microdissector, moeten we eerst gericht de laserstraal op het GFP-positieve weefsel, het maken van een snede langs de geselecteerde omtrek. De microdissector gaat door met het snijden op de geselecteerde snelheid en kracht, maar het is mogelijk om het snijden handmatig verfijnen, totdat het geselecteerde gebied van weefsel valt in de buis eronder. Deze buis bevat een kleine hoeveelheid van de TRI reagens, zodat de GFP-positieve weefsel is klaar voor de volgende RNA-extractie.

We vervolgens verhuisde het snijden gebied aan de overkant, GFP-negatieve kant van de vleugel schijf, om een ​​gelijkwaardige grondgebied ontleden van de unsilenced, GFP-negatieve weefsel. Nogmaals, na de automatische knippen, we overgegaan tot het verfijnen van het snijden handmatig. Eens de snede werd gedaan, ook het GFP-negatieve weefsel werd teruggevonden in de TRI Reagens, klaar voor RNA-extractie.

Deel 3. RNA-extractie en transcriptie Profilering van gemicrodissecteerde Tissue Areas.

We gesponnen de buizen om de vloeistof los te maken van de dop en toegevoegd TRI Reagens tot 1 ml, vervolgens uitgevoerd RNA-extractie uit volgens het standaard TRI Reagens protocol. Voor het verzamelen van voldoende materiaal, herhaalden we het snijden procedure op 100 imaginaire vleugel schijven. Vanaf 100 gebieden van ongeveer 5000 um ² per stuk, onze opbrengst van 1,5 ug van RNA. De nauwkeurigheid van de handleiding dissectie werd vervolgens gecontroleerd door het controleren van GFP expressie in de tot zwijgen gebracht en unsilenced monsters door RT-PCR, met behulp van Super Script III (Invitrogen) te synthetiseren cDNA met willekeurige hexameren. Latere kwantitatieve analyses gericht om de expressie niveaus van het zwijgen gen X bepalen, samen met die van de vermeende doelwitten van haar regelgevende pad, werden uitgevoerd door Real Time RT-PCR met behulp van Master Mix (Invitrogen).

Discussion

Met betrekking tot hun basale expressie niveau bereikt in het voorste / achterste compartimenten van unsilenced vleugel schijven, was de activiteit van de geselecteerde gen X gevonden verlaagd tot 40% na zwijgen op te leggen. In tegenstelling, was een van zijn vermeende doelen (genen Y) significant gevonden up-gereguleerd (7 voudige-toename), die ons tot de hypothese te bevestigen dat het negatief was geregeld door Gene X.

We concluderen dat de hierboven beschreven experimentele benadering succesvol kan worden toegepast op de validatie van vermeende doelwitten van de diverse regelgeving paden.

Daarnaast hebben we vermoeden dat een verbetering van de opbrengst van RNA-extractie snel kunnen karakterisering van gelokaliseerde transcriptie profilering door middel van microarray analyse mogelijk te maken. Dit opent de mogelijkheid om een ​​meer gedetailleerde weergave van belangrijke biologische processen te bereiken. Voor voorbeelden, kan de lokale vorming van morfogenetische hellingen ^{4, 5} of de transcriptionele switch onderstreept het proces van cel concurrentie ^6, waar de verliezen en de winnaar celklonen worden gevisualiseerd door differentiële GFP expressie, kan meer specifiek worden aangepakt. Ongeacht de toepassing, kan deze aanpak helpen om de transcriptionele respons van verschillende cellulaire gebieden in hun eigen weefsel context te definiëren.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DEPC water	Sigma-Aldrich	W4502
RNase Zap	Sigma-Aldrich	R2020
TRI Reagent	Sigma-Aldrich	T9424
SuperScript III	Invitrogen	18080093
Master Mix	Invitrogen	11761100
Agarose	Sigma-Aldrich	A9539
Isopropyl alcohol	Sigma-Aldrich	I9516
Chloroform	Sigma-Aldrich	C7559
Dream taq	Fermentas	EP0701
Fly strains Drosophila UAS-silencing lines can be obtained from VDRC RNAi collection 2. A collection of GAL4-driver lines is available at the Bloomington Drosophila Stock Center (Indiana, USA). Equipment Required equipment includes Laser microdissector (Leica LMD6000), Coulter Microfuge 22R (Beckman), PCR (BIO-RAD My Cycler), Real Time PCR (BIO-RAD iQ5). Tools Required tools include: glass wells, brush, microdissection forceps, hanging drop slides, insect pins mounted on syringe needles, metal frames with PET membrane, plastic tubes (50 ml, 05 ml, 0.25 ml).
Drosophila UAS-silencing lines can be obtained from VDRC RNAi collection 2. A collection of GAL4-driver lines is available at the Bloomington Drosophila Stock Center (Indiana, USA). Equipment Required equipment includes Laser microdissector (Leica LMD6000), Coulter Microfuge 22R (Beckman), PCR (BIO-RAD My Cycler), Real Time PCR (BIO-RAD iQ5). Tools Required tools include: glass wells, brush, microdissection forceps, hanging drop slides, insect pins mounted on syringe needles, metal frames with PET membrane, plastic tubes (50 ml, 05 ml, 0.25 ml).
Equipment Required equipment includes Laser microdissector (Leica LMD6000), Coulter Microfuge 22R (Beckman), PCR (BIO-RAD My Cycler), Real Time PCR (BIO-RAD iQ5). Tools Required tools include: glass wells, brush, microdissection forceps, hanging drop slides, insect pins mounted on syringe needles, metal frames with PET membrane, plastic tubes (50 ml, 05 ml, 0.25 ml).
Required equipment includes Laser microdissector (Leica LMD6000), Coulter Microfuge 22R (Beckman), PCR (BIO-RAD My Cycler), Real Time PCR (BIO-RAD iQ5). Tools Required tools include: glass wells, brush, microdissection forceps, hanging drop slides, insect pins mounted on syringe needles, metal frames with PET membrane, plastic tubes (50 ml, 05 ml, 0.25 ml).
Tools Required tools include: glass wells, brush, microdissection forceps, hanging drop slides, insect pins mounted on syringe needles, metal frames with PET membrane, plastic tubes (50 ml, 05 ml, 0.25 ml).
Required tools include: glass wells, brush, microdissection forceps, hanging drop slides, insect pins mounted on syringe needles, metal frames with PET membrane, plastic tubes (50 ml, 05 ml, 0.25 ml).