Microdissecção a laser Aplicada ao perfil de expressão gênica de subconjunto de células a partir do Drosophila Asa Disco

Aqui fornecemos uma descrição detalhada da microdissecção a laser aplicada para obter o perfil de transcritos de RNA comparativo entre áreas silenciadas e não silenciadas do disco alar de drosófila. Esta abordagem requer, como material biológico, discos imaginais de drosófila dissecados manualmente, e como equipamento principal, um microdissecador a laser. Utilizamos o LI A-L-L-M-D 6,000 e uma máquina de PCR em tempo real.

Utilizamos um BioRad iq. Cinco ferramentas pequenas necessárias são uma placa côncava, um pincel pequeno, pinça de microdissecação, lâmina para gota suspensa, pinças para insetos, montadas em agulhas de seringa, estrutura metálica com membrana de PET e tubos plásticos pequenos. Este método envolve os seguintes passos.

Passo um: cruzar duas linhagens transgênicas oph apropriadas para induzir um silenciamento gênico localizado e específico na prole, fazendo uso do sistema GAL4-UAS. Passo dois: tratar os quadros de dissecação. Passo três: preparar o microdissecador a laser.

Passo quatro, coletar manualmente os discos imaginais das asas da prole larval do cruzamento genético. Passo cinco, realizar a microdissecção a laser de áreas específicas dos discos imaginais marcados com GFP. Passo seis, o perfilamento transcricional de áreas equivalentes das regiões silenciadas e não silenciadas do disco permitirá estabelecer os efeitos provocados pelo silenciamento do seu gene de interesse.

A análise da transcrição in vivo do gene X exigirá a extração de RNA de áreas microdissecadas, controle da precisão da dissecção manual, avaliação da expressão de GFP nas duas amostras por R-T-P-C-R, quantificação da expressão dos alvos putativos do gene silenciado nas duas amostras por R-T-P-C-R em tempo real ou por meio de análise de microarranjo. Agora, mais detalhes sobre cada etapa.

O primeiro passo, o cruzamento genético. O cruzamento genético envolve linhagens transgênicas GAL4-UAS e tem como objetivo obter discos imaginais silenciados na prole larval. O sistema versátil GAL4 permite acionar o silenciamento gênico específico e localizado por interferência de RNA.

Uma linhagem introduz no cruzamento o transgene condutor que expressa GAL4 em um padrão temporal ou espacial específico e um repórter A-U-A-S-G-F-P que permite a visualização do domínio de expressão de GAL4. A segunda linhagem introduz um transgene repórter UAS que expressa um RNA de silenciamento em formato de hairpin, capaz de direcionar especificamente o gene X uma vez expresso na célula.

Esse RNA é clivado para gerar RNA interferente pequeno, que é capaz de silenciar especificamente o gene X selecionado na prole desse cruzamento. O transgene de silenciamento UAS é transcrito apenas nas células que expressam a proteína GAL quatro, induzindo assim um silenciamento espacialmente restrito do gene X. Entre a variedade de aplicações, focamos no perfilamento de transcritos de RNA em discos alares silenciados pelo ativador GAL Grailed, que direciona o silenciamento específico ao compartimento posterior.

A região silenciosa é marcada pela expressão do transgene U-A-S-G-F-P. No compartimento posterior. Dois eventos serão desencadeados: expressão de GGFP e silenciamento do gene x.

Passo dois, tratamento dos quadros de dissecação para inibir a atividade de RNAses. Lave as lâminas e as ferramentas de dissecação com água DEPC por pelo menos uma hora à temperatura ambiente e deixe secar em uma câmara estéril. Para inibir a atividade de RNAses, utilize um tubo novo de 50 ml já livre de RNAses, contendo água DEPC com pinça colocada dentro do tubo, uma lâmina com gota suspensa e um suporte para lâmina.

Ambos necessários para a microdissecção. Feche o tubo, vire-o de cabeça para baixo e deixe reagir por pelo menos uma hora. À temperatura ambiente, uma hora depois, transfira a água com DEPC para outro tubo com a pinça.

Mantenha as lâminas dentro do tubo para que não caiam. Em seguida, deixe as lâminas secarem dentro do tubo. Passo três, configuração da microdissecação.

Primeiramente, ligue todos os dispositivos necessários, a lâmpada de fluorescência, o microscópio e o software para microdissecção. Uma janela de aviso lembrará você de também ligar o laser. Faça isso e deixe o laser aquecer enquanto você finaliza a configuração da microdissecção.

Agora é a hora de preparar os poços nos quais se coletará o tecido. Corte. O equipamento de corte a laser Leica LMD 6,000 permite o carregamento de até quatro tubos para coletar diferentes amostras. Para o nosso propósito, precisamos apenas de dois tubos.

Um, para coletar o tecido silenciado GFP positivo; o outro, para coletar o tecido não silenciado GFP negativo com um micro pincel. Encha ambas as tampas dos tubos com 20 microlitros de solução de tri-reagente para preservar o RNA. Agora, o microdissecção está pronto para uso. Etapa quatro: dissecção manual de discos de imagens de asas de larvas joof.

Isole discos alares da prole larval obtida conforme descrito anteriormente, e certifique-se de que outros tecidos não contaminem os discos. Para alcançar esse objetivo, a abordagem de dissecação é bastante diferente da utilizada comumente para coletar a maior parte dos discos originais. Primeiro, lave a larva em solução de Ringer para remover o meio aderente. Em seguida, transfira-a para uma lâmina com gota pendente e corte a cabeça, puxando imediatamente a boca para baixo.

Usando os alfinetes para insetos, dissecar cuidadosamente os demais tecidos. O contorno vermelho mostra os discos imaginais das asas a serem coletados. Manter os discos livres de tecido aderente de forma rápida e suave. Transferir cada disco isolado da asa para uma estrutura de dissecação para corte imediato.

Este procedimento precisa ser repetido até que o número total de cem discos alares seja alcançado. Passo cinco, microdissecção a laser de áreas específicas dos discos alares marcados com GFP. Uma vez que o disco alar original esteja sobre a membrana, você pode prosseguir com o corte.

Coloque o quadro em seu suporte e fixe o suporte no estágio motorizado. Procure o disco alar original usando o LMD 6,000 como um microscópio comum. Foque nele e defina o corte.

Desenhe uma área oval que se ajuste em ambos os lados do disco, a parte positiva para GFP e a outra. Selecione a tampa do tubo onde deseja coletar a parte positiva para GFP. Pressione o botão Iniciar corte.

O microdissecador prossegue com o corte do tecido com a velocidade e potência definidas anteriormente ao selecionar a função mover e cortar. Você pode refinar manualmente o corte até que a peça não selecionada do tecido caia. A animação 3D mostra o que acontece sob o microdissecador: um laser é focalizado no tecido, fazendo um corte ao longo do perímetro selecionado.

Após o corte, o fragmento de tecido cai na tampa do tubo selecionada e, consequentemente, no tri Reagent. Após o primeiro corte, desloque a área de corte para o outro lado do disco alar para remover uma região equivalente negativa para GFP. Antes de realizar o novo corte, certifique-se de selecionar uma tampa de tubo diferente para manter separados os tecidos positivos para GFP dos tecidos negativos para GFP.

Pressione o botão de corte inicial após o corte automático. Prossiga para refinar o corte manualmente conforme mostrado pela animação 3D antes do segundo corte. A platina motorizada move a tampa do tubo selecionada para baixo da área de corte.

O feixe do laser é focalizado no tecido cortado ao longo do perímetro selecionado, e, uma vez concluído o corte, o fragmento de tecido cai na tampa do tubo selecionada, contendo o reagente Tri. Para coletar material suficiente, repetimos o procedimento em cem discos imaginais de asa. Após coletar as amostras, retire os tubos.

Esta é uma etapa delicada que pode fazer você perder todo o trabalho realizado até agora. Portanto, tenha cuidado. Feche a tampa com a parte de baixo virada para cima e prossiga com o experimento.

Este é o que possui tecido positivo para GFP. Este é o outro com tecido negativo para GFP. Passo seis, perfilagem de transcrição.

Centrifugue os tubos para destacar o líquido da tampa e adicione o reagente Try até um mililitro. Realize a extração de RNA seguindo o protocolo padrão do reagente Try a partir de cem áreas de aproximadamente 5.000 micrômetros quadrados cada. O nosso rendimento foi de 1,5 microgramas de RNA.

Utilizamos o Superscript Três da Vitrogen para sintetizar CD NA com hexâmeros aleatórios. A precisão da dissecação manual foi controlada mediante a verificação da expressão de GFP nas duas amostras por R-T-P-C-R. Conforme mostrado no gel com R-T-P-C-R quantitativo.

Avaliamos os níveis de expressão do gene silenciado X juntamente com os de possíveis alvos putativos da via regulatória mediada pelo gene X. Este diagrama mostra um exemplo dos níveis de expressão do gene X e de um de seus alvos putativos. Denomine-os genes Y em relação aos seus níveis de expressão basal nos compartimentos anterior e posterior de discos de asas não solidificados.

A atividade do gene X selecionado foi reduzida a 40% após o silenciamento. Em contraste, um de seus alvos putativos, o gene Y, apresentou significativa superexpressão, com um aumento sete vezes maior, levando-nos a validar a hipótese de que ele é negativamente regulado pelo gene X. Concluímos que a abordagem experimental acima descrita pode ser aplicada com sucesso na validação de alvos putativos em diversas vias regulatórias.