Microdissecção a laser Aplicada ao perfil de expressão gênica de subconjunto de células a partir do Drosophila Asa Disco

Aqui, fornecemos uma descrição completa da microdissecção a laser aplicada para obter um perfil de transcrição de RNA comparado de áreas silenciadas e não silenciadas do disco da asa da drosófila. Esta abordagem requer como material biológico, discos de imagem de drosófila dissecados manualmente como equipamento principal, um microdissector a laser. Usamos o LI A-L-L-M-D 6.000 e uma máquina de PCR em tempo real.

Usamos um BioRad iq. Cinco pequenas ferramentas necessárias são uma placa côncava, uma pequena pinça de microdissecação de pincel pendurada pings de insetos de deslizamento, montada em agulhas de seringa, estrutura de metal com pequenos tubos de plástico de membrana para animais de estimação. Este método envolve as seguintes etapas.

Primeiro passo para cruzar duas linhagens transgênicas oph adequadas, a fim de desencadear um silenciamento gênico localizado e específico na progênie fazendo uso do sistema GAL quatro UAS. Etapa dois, para tratar os quadros de dissecação. Etapa três, para configurar o micro dissector a laser.

Etapa quatro, para coletar manualmente os discos imaginais da asa da progênie larval do cruzamento genético. Etapa cinco, para realizar a microdissecção a laser de áreas específicas dos discos imaginais marcados com GFP. Etapa seis, o perfil de transcrição de áreas equivalentes de regiões silenciadas e não sólidas do disco permitirá o estabelecimento dos efeitos desencadeados pelo silenciamento de seu gene de interesse.

Chame-o de gene X o perfil de transcrição in vivo exigirá extração de RNA das áreas micro dissecadas, controle da precisão da dissecção manual, avaliação da expressão de GFP nas duas amostras por RTPCR, quantificação da expressão de putativo. Alvos do gene do silêncio nas duas amostras por RTPC em tempo real ou realizando uma análise de microarray. Agora, mais detalhes sobre cada etapa.

O primeiro passo, o cruzamento genético. O cruzamento genético envolve GAL quatro cepas transgênicas de UAS e é focado na obtenção de discos imaginais silenciados na progênie larval. O sistema Versatile GAL four permite desencadear o silenciamento de genes específicos e localizados por interferência de RNA.

Uma cepa introduz no cruzamento o transgene condutor que expressa GAL quatro em um padrão temporal ou espacial específico. E repórter A-U-A-S-G-F-P que permite a visualização do domínio de expressão GAL quatro. A segunda cepa introduz um transgene respondedor UAS que expressa RNA silenciador de grampo de cabelo, capaz de atingir especificamente o gene X uma vez expresso na célula.

Este RNA é clivado para gerar um pequeno RNA interferente, que é capaz de silenciar especificamente o gene X selecionado na progênie desse cruzamento. O transgene silenciador UAS é transcrito apenas nas células que expressam a proteína GAL quatro, induzindo assim um silenciamento espacialmente restrito do gene X. Entre a variedade de aplicações, nos concentramos no perfil de transcrição de RNA em disco de asa silenciado pelo Grailed GAL quatro driver, que direciona o silenciamento específico no compartimento posterior.

A região do silêncio é marcada pela expressão do transgene U-A-S-G-F-P. No compartimento posterior. Dois eventos serão desencadeados expressão de GGFP e silenciamento do gene x.

Etapa dois, tratamento dos quadros de dissecção para inibir a atividade dos RNAs. Lave as lâminas da estrutura e as ferramentas de dissecção com água DEPC por pelo menos uma hora em temperatura ambiente e deixe-as secar em uma câmara estéril. Para inibir a atividade dos RNAs, use um novo tubo de 50 ml já livre de RNAs, preenchido com água DEPC com pinças colocadas no tubo, uma lâmina suspensa e uma estrutura para animais de estimação.

Ambos necessários para a microdissecção. Feche o tubo, vire-o de cabeça para baixo e deixe-o reagir por pelo menos uma hora. À temperatura ambiente, uma hora depois, mova a água DEPC para outro tubo com a pinça.

Segure as corrediças dentro do tubo para que não caiam. Em seguida, deixe as lâminas secarem dentro do tubo. Etapa três, configuração do microdissecto.

Em primeiro lugar, ligue todos os dispositivos necessários, a lâmpada de fluorescência, o microscópio e o software para a microdissecção. Uma janela de aviso irá lembrá-lo de ligar também o laser. Faça isso e deixe o laser aquecer enquanto você termina a configuração do microdispositivo.

Agora é hora de preparar os poços para coletar o tecido. Cortar. O equipamento de corte a laser Leica LMD 6.000 permite o carregamento de até quatro tubos para coletar amostras diferentes. Para o nosso propósito, precisamos de apenas dois tubos.

Um, para coletar o tecido de silêncio positivo GFP, o outro para coletar tecido unil negativo GFP com um micro pec. Encha ambas as tampas dos tubos com 20 microlitros de solução tri-reagente para preservar o RNA. Agora o microdisect está pronto para uso Etapa quatro, dissecção manual dos discos de imagem da asa das larvas de joof.

Isole os discos das asas da progênie larval obtida conforme descrito anteriormente e certifique-se de que outros tecidos não contaminem os discos Para atingir esse objetivo, a abordagem de dissecação é bem diferente daquela comumente usada para coletar a maior parte de todos os discos originais. Primeiro, lave a larva em solução de ringer para remover os meios aderentes. Em seguida, transfira-o para uma lâmina suspensa e corte a cabeça imediatamente puxando a boca para baixo.

Usando os alfinetes de insetos, agora disseque cuidadosamente outros tecidos. O contorno vermelho mostra os discos de asa imaginários a serem coletados. Mantenha os discos livres do tecido aderente de forma rápida e suave Transfira cada disco de asa isolado para uma estrutura de dissecção para corte imediato.

Este procedimento precisa ser repetido até que o número total de cem discos de asa seja alcançado. Etapa cinco, microdissecção a laser de áreas específicas de discos de asa marcados com GFP. Uma vez que o disco da asa original esteja na membrana, você pode prosseguir com o corte.

Coloque a estrutura em seu suporte e fixe o suporte no motorizado stage. Procure o disco de asa original usando o LMD 6.000 como um microscópio comum. Concentre-se nisso e defina o corte.

Desenhe uma área oval que caiba em ambos os lados do disco, o GFP positivo e o outro. Selecione a tampa do tubo onde deseja coletar a parte positiva GFP. Pressione o botão Iniciar corte.

O micro dissector Prossegue com o corte do tecido com a velocidade e a potência que você definiu antes, selecionando a função mover e cortar. Você pode refinar o corte manualmente até que o pedaço de tecido não selecionado caia. A animação 3D mostra o que acontece sob os micros Dissector cortar um laser sendo focado no tecido Fazendo um corte ao longo do perímetro selecionado.

Uma vez feito o corte, o pedaço de tecido cai na tampa do tubo selecionada e, consequentemente, no tri Reagent. Após o primeiro corte, mova a área de corte do outro lado do disco da asa para cortar uma área negativa GFP equivalente. Antes de prosseguir com o novo corte, certifique-se de selecionar uma tampa de tubo diferente para manter separados os tecidos positivos para GFP dos negativos para GFP.

Pressione o botão de início de corte após o corte automático. Prossiga para refinar o corte manualmente, conforme mostrado pela animação 3D antes do segundo corte. A platina motorizada move a tampa do tubo selecionada sob a área de corte.

O feixe de laser se concentra no tecido cortado ao longo do perímetro selecionado e, uma vez feito o corte, o pedaço de tecido cai na tampa do tubo selecionada contendo o reagente Tri. Para coletar material suficiente, Repetimos o procedimento em uma centena de discos de asa imaginários. Depois de coletar as amostras, descarregue os tubos.

Este é um passo delicado que pode fazer você perder todo o trabalho que fez até agora. Portanto, tenha cuidado. Feche a tampa de cabeça para baixo e prossiga com o experimento.

Este é aquele com tecido positivo para GFP. Este é o outro com tecido negativo para GFP. Etapa seis, perfil de transcrição.

Gire os tubos para separar o líquido da tampa e adicione o reagente Try até um mililitro. Realize a extração de RNA seguindo o protocolo padrão de reagente de tentativa de cem áreas de cerca de 5.000 micrômetros quadrados cada. Nosso rendimento foi de 1,5 microgramas de RNA.

Usamos o sobrescrito três in vitrogen para sintetizar o CD NA com hexa aleatório. A acurácia da dissecção manual foi controlada pela verificação da expressão de GFP nas duas amostras por R-T-P-C-R. Como mostrado no gel com R-T-P-C-R quantitativo.

Avaliamos os níveis de expressão do gene X do silêncio juntamente com os de possíveis alvos putativos da via regulatória mediada pelo gene X. Este diagrama mostra um exemplo dos níveis de expressão do gene X e de um de seus alvos putativos. Chame-os de genes Y em relação aos seus níveis de expressão basal nos compartimentos ântero-posteriores dos discos das asas não sólidos.

A atividade do gene X selecionado foi reduzida para 40% após o silenciamento. Em contraste, um de seus alvos putativos, o gene Y, foi significativamente regulado positivamente em um aumento de sete vezes, levando-nos a validar a hipótese de que ele foi regulado negativamente pelo gene X. Concluímos que a abordagem experimental descrita acima pode ser aplicada com sucesso à validação de alvos putativos em diversas vias regulatórias.