Name: Microdissecção a laser Aplicada ao perfil de expressão gênica de subconjunto de células a partir do Drosophila Asa Disco (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-04-30T17:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 59 s
Description: Aprenda microdissecção a laser para perfil de expressão gênica em subconjuntos celulares do disco de asa de Drosophila. Este método permite analisar áreas silenciadas e não silenciadas, revelando regulação gênica em tecidos nativos.

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Os autores agradecem a prof. Chiara Campanella e AMRA Centro de Competência da Universidade de Nápoles Federico II, Nápoles, Itália, para proporcionar-lhes o uso do microdissector laser, e Vincenzo Vicidomini ajuda generosa na animação 3D.

Parte 1. Preparação de discos Drosophila Asa Imaginal Sujeitos a RNAi específica e localizada. Como material biológico, foram utilizados discos de Drosophila asa imaginal obtido a partir de larvas transgênicas submetidas ao silenciamento de genes localizados e específicos, por meio do sistema GAL4/UAS 1. Esta progênie larval orginates de um cruzamento genético envolvendo duas linhas parentais: uma carregando o driver GAL4, o segundo a responder UAS. Além de expressar GAL4 no padrão temporal específica e / ou espacial, a linha do driver carrega um repórter UAS-GFP, que permite visualizar a expressão de domínio GAL4. A linha de resposta UAS expressa, sob o controle da seqüência UAS, um hairpin silenciamento de RNA (hpRNA) capaz de visar especificamente o gene de interesse seleccionados (chamemos-lhe gene X) 2. Uma vez expresso na célula, o X hpRNA é clivada para gerar pequeno RNA de interferência (siRNA) capaz de silenciar o gene especificamente selecionados. Na progênie larval, que leva o condutor e responder transgenes, a construção UAS silenciar só é transcrito nas células que expressam a proteína GAL4 e, portanto, é capaz de induzir um silenciamento espacialmente restrita do gene selecionadas X. Entre a variedade de aplicações possíveis, aplicou-se esta abordagem para silenciar um gene selecionado de nosso interesse (gene X) sob o controle do engrailed-GAL4 (en) driver, que pode desencadear o silenciamento específico no compartimento posterior do disco ala de 3 , cujo território foi marcado pela expressão do transgene UAS-GFP. O silenciados discos asa imaginal mão-foram dissecados, tendo o cuidado de eliminar tecidos circundantes contaminação, especialmente a traquéia aderir. Cada disco ala isolada foi então rapidamente e delicadamente transferido para um, RNase previamente tratados quadro dissecção livre para microdissecção a laser imediata de áreas selecionadas. Parte 2. Microdissecção a laser de áreas selecionadas a partir do silêncio (posterior) e unsilenced (anterior) compartimentos do disco asa. Uma vez que o disco foi asa na membrana, microdissecção a laser de áreas específicas de silenciados (posterior; GFP-rotulados) e unsilenced (anterior; GFP-unlabelled) compartimentos foi alcançado. Este desenho foi realizado por uma área que poderia se encaixar facilmente em ambos, os lados positivos e GFP-GFP-negativos do disco. Sob a microdissector, primeiro foco do raio laser sobre o tecido GFP-positivo, fazendo um corte ao longo do perímetro selecionado. O produto microdissector com corte na velocidade selecionada e poder, mas é possível refinar o corte manualmente, até que a área selecionada de tecido cai no tubo embaixo. Este tubo contém um pequeno volume do Reagente TRI, de modo que o tecido GFP-positivo está pronto para a extração de RNA subseqüentes. Nós posteriormente mudou-se a área de corte para o oposto, GFP-negativos lado do disco asa, a fim de dissecar um território equivalente a partir da unsilenced, tecido GFP-negativos. Mais uma vez, após o corte automático, procedeu-se a refinar o corte manual. Uma vez que o corte foi feito, também o tecido GFP-negativos foi recuperada na Reagente TRI, pronto para a extração de RNA. Parte 3. A extração de RNA e perfil de transcrição de Áreas Tissue microdissecção. Nós girou os tubos para separar o líquido do cap e acrescentou Reagente TRI até 1 ml, então realizada extração de RNA, seguindo o protocolo padrão Reagente TRI. Para coletar material suficiente, nós repetimos o procedimento de corte em 100 discos de asa imaginal. A partir de 100 áreas de cerca de 5000 M 2 cada, nosso rendimento foi de 1,5 microgramas de RNA. Precisão da dissecção manual foi então controlado por verificação expressão GFP nas amostras silenciadas e unsilenced por RT-PCR, usando Super Script III (Invitrogen) para sintetizar cDNA com hexâmeros Random. Subseqüentes análises quantitativas focado para determinar os níveis de expressão do gene X silenciado, juntamente com os dos alvos putativos de sua via de regulamentação, foram realizadas por Real Time RT-PCR usando Master Mix (Invitrogen).

<ol><li>Elliott, D. A., Brand, A. H. The GAL4 System A Versatile System for the Expression of Gene. Dahmann, C. , Humana Press Inc. Totowa, NJ. (2008).</li>
<li>Klein, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wing+disc+development+in+the+fly%3A+the+early+stages.+%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Genetics+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Wing disc development in the fly: the early stages. </a> Current Opinion in Genetics & Development. 11, 470-475 (2001).</li>
<li>Dietzl, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genome-wide+transgenic+RNAi+library+for+conditional+gene+inactivation+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A genome-wide transgenic RNAi library for conditional gene inactivation in Drosophila.</a> Nature. 448, 151-U1-151-U1 (2007).</li>
<li>Martin, F. A., Morata, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compartments+and+the+control+of+growth+in+the+Drosophila+wing+imaginal+disc%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Compartments and the control of growth in the Drosophila wing imaginal disc.</a> Development. 133, 4421-4426 (2006).</li>
<li>Tabata, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetics+of+morphogen+gradients%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Genetics of morphogen gradients.</a> Nature Reviews Genetics. 2, 620-630 (2001).</li>
<li>Moreno, E. &amp, Basler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((dMyc+transforms+cells+into+super-competitors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">dMyc transforms cells into super-competitors.</a> Cell. 117, 117-129 (2004).</li>
</ol>

Em relação aos seus níveis de expressão basal alcançado nos compartimentos anterior / posterior da asa unsilenced discos, a atividade do gene X selecionada foi encontrado reduzidos para 40% sobre o silenciamento. Em contraste, um dos seus alvos putativos (genes Y) foi encontrada significativamente sobre-regulada (7 vezes maior), levando-nos para validar a hipótese de que ela foi regulada negativamente pelo gene X. Concluímos que a abordagem acima descrita experimental pode ser aplicado com s...

Fly cepas Drosophila UAS silenciando-linhas podem ser obtidas VDRC RNAi coleção de 2. Uma coleção de GAL4 driver-linhas está disponível no Drosophila Bloomington stock Center (Indiana, EUA). Equipamento Equipamentos necessários inclui Laser microdissector (Leica LMD6000), Coulter Microcentrifugue 22R (Beckman), PCR (BIO-RAD My Cycler), Real Time PCR (BIO-RAD iQ5). Ferramentas Ferramentas necessárias incluem: poços de vidro, escova, pinça de microdissecção, slides gotas de suspensão, alfinetes de insetos montados em agulhas de seringa, armações de metal com membrana PET, tubos de plástico (50 ml, 05 ml, 0,25 ml).

microdissecção a laser aplicada ao perfil de expressão gênica de subconjunto de células a partir do drosophila asa disco

Laser Microdissection Applied to Gene Expression Profiling of Subset of Cells from the Drosophila Wing Disc

Heterogeneidade de tecidos tem provado ser um fator limitante na quantidade de informações que podem ser gerados a partir de amostras biológicas, comprometendo análises a jusante. Considerando-se as associações complexas e dinâmicas celulares existentes dentro muitos tecidos, a fim de recapitular a nas interações vivo análise minuciosa molecular é preciso ser capaz de analisar populações de células específicas dentro de seu contexto nativo. Laser mediada por microdissecção pode alcançar este objetivo, permitindo uma identificação inequívoca e colheita bem-sucedida de células de interesse sob visualização microscópica direta, mantendo a integridade molecular. Temos aplicado esta tecnologia para analisar a expressão de gene dentro das áreas definidas do desenvolvimento de Drosophila disco asa, o que representa um sistema modelo para estudar vantajoso controlar o crescimento, diferenciação celular e organogênese. Larval discos imaginais são precocemente subdividida em compartimentos anterior e posterior, dorsal e ventral por fronteiras restrição linhagem. Fazendo uso da induzível GAL4-UAS sistema de expressão de binário, cada um desses compartimentos podem ser rotulados especificamente em moscas transgênicos expressando um transgene UAS-GFP sob o controle do driver apropriado GAL4 construir. Nos discos transgênicos, perfil de expressão gênica de subconjuntos discretos de células pode ser determinada precisamente após laser-mediada microdissecção, usando o sinal fluorescente GFP para guia de corte a laser. Entre a variedade de aplicações a jusante, nos concentramos em RNA perfil transcrição localizada após interferência de RNA (RNAi). Com o advento da tecnologia de RNAi, GFP rotulagem podem ser acoplados com knockdown localizada de um determinado gene, o que permite determinar a resposta transcricional de uma população de células discretas para o silenciamento de genes específicos. Para validar esta abordagem, dissecamos áreas equivalentes do disco do posterior (rotulada pela expressão GFP), eo compartimento (sem identificação) anterior ao silenciamento regionais no compartimento de P de um gene de outra forma ubiquitously expressa. RNA foi extraído de microdissecção áreas silenciadas e unsilenced e perfil de expressão gênica comparativa determinado pelo quantitativo em tempo real, RT-PCR. Nós mostramos que este método pode ser aplicado de forma eficaz para transcriptômica precisa de subconjuntos de células dentro dos discos Drosophila imaginal. De fato, enquanto a preparação do disco massivo como fonte de RNA geralmente assume homogeneidade celular, é bem sabido que a expressão transcricional pode variar muito dentro dessas estruturas em conseqüência da informação posicional. Usando o sinal fluorescente GFP localizada a guia de corte a laser, mais precisas análises de transcrição pode ser realizada e rentável aplicado a diferentes aplicativos, incluindo perfis de transcrição de linhagens celulares distintas dentro de seu contexto nativo.

Microdissecção a laser foi aplicado para analisar perfil de expressão gênica em compartimentos específicos de Drosophila disco asa submetido a RNAi localizada<em&gt; In vivo</em&gt;. RNA extraído de áreas equivalentes de compartimentos silenciadas e unsilenced foi analisado por RT-PCR quantitativa para determinar perfis de expressão gênica comparativa no contexto da microecologia tecido nativo.

Microdissecção a laser Aplicada ao perfil de expressão gênica de subconjunto de células a partir do Drosophila Asa Disco

A natureza heterogênea dos tecidos tem se mostrado um fator limitante na quantidade de informações que podem ser geradas a partir de amostras biológicas, ...

Aqui fornecemos uma descrição detalhada da microdissecção a laser aplicada para obter o perfil de transcritos de RNA comparativo entre áreas silenciadas e não silenciadas do disco alar de drosófila. Esta abordagem requer, como material biológico, discos imaginais de drosófila dissecados manualmente, e como equipamento principal, um microdissecador a laser. Utilizamos o LI A-L-L-M-D 6,000 e uma máquina de PCR em tempo real.Utilizamos um BioRad iq. Cinco ferramentas pequenas necessárias são uma placa côncava, um pincel pequeno, pinça de microdissecação, lâmina para gota suspensa, pinças para insetos, montadas em agulhas de seringa, estrutura metálica com membrana de PET e tubos plásticos pequenos. Este método envolve os seguintes passos.Passo um: cruzar duas linhagens transgênicas oph apropriadas para induzir um silenciamento gênico localizado e específico na prole, fazendo uso do sistema GAL4-UAS. Passo dois: tratar os quadros de dissecação. Passo três: preparar o microdissecador a laser.Passo quatro, coletar manualmente os discos imaginais das asas da prole larval do cruzamento genético. Passo cinco, realizar a microdissecção a laser de áreas específicas dos discos imaginais marcad

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Biologia

Neste vídeo-artigo apresentamos um método para isolar um ou...

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