Microdissection לייזר יישומית כדי Gene Expression Profiling של תת קבוצה של תאים מן תסיסנית אגף דיסק

Summary

Microdissection לייזר יושמה כדי לנתח את הביטוי פרופיל גנטי בתאים מסוימים של הדיסק כנף תסיסנית נתון RNAi מקומי

Abstract

טבע הטרוגניות של רקמות הוכיחה להיות גורם מגביל בסכום של מידע ניתן להפיק מן דגימות ביולוגיות, להתפשר על מנתח במורד הזרם. בהתחשב עמותות הסלולר מורכב ודינמי הקיימים בתוך רקמות רבות, על מנת לשחזר את הניתוח באינטראקציות vivo מולקולרית יסודי אחד חייב להיות מסוגל לנתח אוכלוסיות תאים ספציפיים בהקשר הטבעי שלהם. לייזר בתיווך microdissection יכולים להשיג מטרה זו, המאפשרת זיהוי חד משמעי וקציר מוצלח של תאים בעלי עניין תחת להדמיה מיקרוסקופית ישירה תוך שמירה על שלמות מולקולרית. יש לנו ליישם את הטכנולוגיה הזאת כדי לנתח ביטוי גנים באזורים מוגדרים של הדיסק בפיתוח האגף תסיסנית, המייצג את מערכת מודל יתרון ללמוד לשלוט צמיחה, התמיינות תאים ו organogenesis. הדיסקים מחולקים דמותי הזחל מפותח על ידי גבולות הגבלה השושלת לתאים הקדמי ואת האחורי, הגבי ו הגחון. עשיית שימוש של ועין מתנהלת GAL4-כטב"מ ביטוי בינארי המערכת, כל אחד תאים אלה יכולים להיות מתויג במיוחד זבובים מהונדס המבטא כטב"מ-GFP transgene בשליטת המתאים GAL4 נהג לבנות. ב הדיסקים מהונדס, ביטוי גנים פרופיל של תת דיסקרטית של תאים יכול להיקבע בדיוק אחרי microdissection לייזר בתיווך, באמצעות אותות ה-GFP ניאון מדריך לחתוך לייזר.

בין מגוון של יישומים במורד הזרם, אנו מתמקדים פרופיל תעתיק הרנ"א לאחר מקומי התערבות RNA (RNAi). עם כניסתו של RNAi הטכנולוגיה, GFP תיוג יכול להיות בשילוב עם מציאה מקומי של גן מסוים, המאפשר דטרמיניסטיות תעתיק את התגובה של האוכלוסייה תא בדידים כדי להשתיק את הגן הספציפי. כדי לאמת גישה זו, ניתחנו אזורים המקבילה של הדיסק מן האחורי (מסומן על ידי ביטוי של GFP), ואת תא קדמי (תווית) על השתקה אזורי בתא P של הגן אחרת לידי ביטוי בכל מקום בגוף. RNA הופק מאזורים הושתק unsilenced microdissected ואת הגן השוואתי הביטוי פרופיל נקבע על ידי כמותי בזמן אמת RT-PCR. אנו מראים כי בשיטה זו יכול למעשה להיות מיושם עבור transcriptomics מדויק של תת קבוצות של תאים בתוך הדיסקים דמותי תסיסנית. ואכן, תוך הכנת דיסק מסיבי כמקור של RNA בדרך כלל מניחה הומוגניות התא, זה ידוע היטב כי הביטוי תעתיק יכול להשתנות במידה רבה בתוך מבנים אלה עקב מידע מיקומית. בעזרת ה-GFP מקומי אות ניאון מדריך לחתוך לייזר, ניתוחים תעתיק מדויק יותר ניתן לבצע ויישומי רווחי ליישומים שונים, כולל פרופיל תמליל של שושלות תאים נפרדים בהקשר הטבעי שלהם.

Protocol

חלק 1. הכנת דיסקים תסיסנית דמותי אגף נתון RNAi ספציפיים לשפות אחרות.

כמו חומר ביולוגי, השתמשנו תסיסנית דיסקים דמותי כנף המתקבל הזחלים מהונדס נתון השתקת הגן מקומיים ספציפיים באמצעות המערכת GAL4/UAS ^1. זה הצאצאים הזחל orginates מן הצלב גנטית מעורבים שני קווים ההורים: האחד נושא את הנהג GAL4, השני מגיב כטב"מ. בנוסף להביע GAL4 דפוס הזמני ספציפיים ו / או מרחבית, קו הנהג נושא כתב כטב"מ-GFP המאפשר לחזות את תחום GAL4 הביטוי. הקו המגיב כטב"מ מבטא, תחת שליטתו של רצף כטב"מ, מכבנה השתקת RNA (hpRNA) מסוגלים במיוחד למקד את הגן הנבחר של עניין (קוראים לזה גן X) ^2. הביע פעם בתא, X hpRNA הוא ביקע ליצירת RNA התערבות קטנה (siRNA) מסוגלים במיוחד להשתיק את הגן שנבחר. בשנת הצאצאים הזחל, שנושאת גם הנהג המגיב transgenes, לבנות כטב"מ-ההשתקה הוא עיבד רק באותם תאים המבטאים את חלבון GAL4, וכך הוא מסוגל לגרום השתקה מוגבלת מרחבית של הגן X. נבחרים

בין מגוון של יישומים אפשריים, אנו ליישם את הגישה הזאת כדי להשתיק גן נבחרים של האינטרס שלנו (גן X) תחת שליטה של engrailed-GAL4 (en) נהג, אשר יכול להפעיל השתקה ספציפיים בתא האחורי של הדיסק כנף ³ , שטח אשר סומן על ידי ביטוי של transgene כטב"מ-GFP.

הדיסקים השתיק כנף דמותי היו ביד גזור, דואג לחסל זיהום ברקמות שמסביב, ובעיקר דבקות וקנה הנשימה. דיסק כל אגף מבודד אז הועבר במהירות ובעדינות על מסגרת שטופלו בעבר RNase, דיסקציה חינם microdissection לייזר מיידי של אזורים נבחרים.

חלק 2. לייזר microdissection של אזורים נבחרים מן (קדמית) תאים השתיק (האחורי) ו unsilenced של הדיסק כנף.

לאחר דיסק האגף היה על הממברנה, microdissection לייזר של אזורים ספציפיים של השתיק (האחורי; GFP שכותרתו) ו unsilenced (קדמית, GFP-תווית) תאים הושגה. זה בוצע על ידי ציור שטח זה יכול בקלות להשתלב בשני הצדדים GFP-GFP חיובי שלילי של הדיסק. תחת microdissector, אנחנו הראשונים התמקדה קרן הלייזר על הרקמה GFP חיובי, ביצוע חתך לאורך המערכת שנבחרה. התמורה microdissector עם חיתוך במהירות שנבחרה כוח, אבל זה אפשרי כדי לחדד את חיתוך ידני, עד האזור הנבחר של רקמת נופל הצינור מתחת. צינורית זו מכילה נפח קטן של מגיב TRI, כך רקמות GFP חיובי מוכן להפקת RNA הבאים.

אנו מכן עבר האזור חיתוך אל מול, GFP שלילי הצד של הדיסק כנף, על מנת לנתח שטח שווה ערך מן הרקמה unsilenced GFP-שלילי. שוב, אחרי לחתוך את האוטומטי, אנו המשיך הזיקוק לחתוך באופן ידני. לאחר לחתוך נעשתה, גם את רקמת ה-GFP שלילי נמצאה בתוך מגיב TRI, מוכן להפקת RNA.

חלק 3. הפקת RNA ו פרופיל תמלול מאזורים רקמות Microdissected.

סובבנו את הצינורות כדי לנתק את הנוזל מתוך כובע והוסיף מגיב TRI עד 1 מ"ל, ואז ביצע מיצוי רנ"א בעקבות פרוטוקול מגיב תקן TRI. כדי לאסוף מספיק חומר, אנחנו חוזרים ונשנים את הליך החיתוך על 100 דיסקים כנף דמותי. החל מ 100 מיקרומטר על שטחי 5000 ² כל אחד, התשואה שלנו היתה של 1.5 מיקרוגרם של רנ"א. דיוק של דיסקציה ידנית נשלט אז על ידי בדיקת ביטוי של GFP בדגימות הושתק unsilenced על ידי RT-PCR, באמצעות סופר סקריפט III (Invitrogen) לסנתז cDNA עם Hexamers אקראיים. ניתוחים כמותיים לאחר ממוקד כדי לקבוע את רמות הביטוי של גנים מושתקים X, יחד עם אלו של יעדים המשוערת של מסלול הרגולציה שלה, בוצעו על ידי זמן אמת RT-PCR באמצעות מאסטר מיקס (Invitrogen).

Discussion

לגבי רמות הבסיס שלהם ביטוי להשיג התאים קדמית / אחורית של דיסקים כנף unsilenced, הפעילות של הגן X שנבחר נמצא מופחת 40% על ההשתקה. לעומת זאת, אחת המטרות המשוערת שלה (גנים Y) נמצא באופן משמעותי מעלה מוסדר (7 מתקפלת עליה), מוביל אותנו כדי לאמת את ההשערה כי זה היה מוסדר באופן שלילי על ידי גן X.

אנו מסיקים כי הגישה הניסוי המתואר לעיל יכול להיות מיושם בהצלחה אימות של מטרות המשוערת של מסלולים רגולטוריים שונים.

בנוסף, אנו לשער כי שיפור בתשואה של מיצוי RNA יכול במהירות לאפשר אפיון של פרופיל שעתוק מקומי על ידי ניתוח microarray. פעולה זו תפתח את האפשרות להשיג עוד תצוגה מפורטת של תהליכים ביולוגיים חשובים. לדוגמאות, היווצרות מקומית של המוךפו"גנטי שהולך מילויים ^{4, 5} או עם הבורר תעתיק להדגיש את התהליך של התחרות תא ^6, שבה להפסד של התא משכפל הזוכה ניתן דמיינו ידי ביטוי של GFP ההפרש, יכול להתייחס באופן ספציפי יותר. מה את היישום, גישה זו יכולה לעזור לקבוע את התגובה תעתיק של השטחים סלולריים שונים בהקשר רקמות האם שלהם.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DEPC water	Sigma-Aldrich	W4502
RNase Zap	Sigma-Aldrich	R2020
TRI Reagent	Sigma-Aldrich	T9424
SuperScript III	Invitrogen	18080093
Master Mix	Invitrogen	11761100
Agarose	Sigma-Aldrich	A9539
Isopropyl alcohol	Sigma-Aldrich	I9516
Chloroform	Sigma-Aldrich	C7559
Dream taq	Fermentas	EP0701
Fly strains Drosophila UAS-silencing lines can be obtained from VDRC RNAi collection 2. A collection of GAL4-driver lines is available at the Bloomington Drosophila Stock Center (Indiana, USA). Equipment Required equipment includes Laser microdissector (Leica LMD6000), Coulter Microfuge 22R (Beckman), PCR (BIO-RAD My Cycler), Real Time PCR (BIO-RAD iQ5). Tools Required tools include: glass wells, brush, microdissection forceps, hanging drop slides, insect pins mounted on syringe needles, metal frames with PET membrane, plastic tubes (50 ml, 05 ml, 0.25 ml).
Drosophila UAS-silencing lines can be obtained from VDRC RNAi collection 2. A collection of GAL4-driver lines is available at the Bloomington Drosophila Stock Center (Indiana, USA). Equipment Required equipment includes Laser microdissector (Leica LMD6000), Coulter Microfuge 22R (Beckman), PCR (BIO-RAD My Cycler), Real Time PCR (BIO-RAD iQ5). Tools Required tools include: glass wells, brush, microdissection forceps, hanging drop slides, insect pins mounted on syringe needles, metal frames with PET membrane, plastic tubes (50 ml, 05 ml, 0.25 ml).
Equipment Required equipment includes Laser microdissector (Leica LMD6000), Coulter Microfuge 22R (Beckman), PCR (BIO-RAD My Cycler), Real Time PCR (BIO-RAD iQ5). Tools Required tools include: glass wells, brush, microdissection forceps, hanging drop slides, insect pins mounted on syringe needles, metal frames with PET membrane, plastic tubes (50 ml, 05 ml, 0.25 ml).
Required equipment includes Laser microdissector (Leica LMD6000), Coulter Microfuge 22R (Beckman), PCR (BIO-RAD My Cycler), Real Time PCR (BIO-RAD iQ5). Tools Required tools include: glass wells, brush, microdissection forceps, hanging drop slides, insect pins mounted on syringe needles, metal frames with PET membrane, plastic tubes (50 ml, 05 ml, 0.25 ml).
Tools Required tools include: glass wells, brush, microdissection forceps, hanging drop slides, insect pins mounted on syringe needles, metal frames with PET membrane, plastic tubes (50 ml, 05 ml, 0.25 ml).
Required tools include: glass wells, brush, microdissection forceps, hanging drop slides, insect pins mounted on syringe needles, metal frames with PET membrane, plastic tubes (50 ml, 05 ml, 0.25 ml).