MALDI preparação da amostra: o método de Camada Ultra Thin

Summary

Este vídeo demonstra a preparação de uma ultra-fina camada de matriz / analito para a análise de peptídeos e proteínas por Matrix Assisted Laser-ionização dessorção Espectrometria de Massa (MALDI-MS).

Abstract

Este vídeo demonstra a preparação de uma ultra-fina camada de matriz / analito para a análise de peptídeos e proteínas por Matrix Assisted Laser-ionização dessorção Espectrometria de Massa (MALDI-MS) ^{1, 2.} O método de camada ultra-fina envolve a produção de uma camada de substrato de cristais de matriz (alfa-ciano-4-hidroxicinâmicos ácido) na placa de amostra, que serve como um campo de semeadura para a cristalização de uma mistura subseqüentes matriz / analito. Vantagens do método de camada ultra-fina sobre abordagens outra amostra de deposição (gotículas secas, por exemplo) são de que ele fornece (i) maior tolerância às impurezas tais como sais e detergentes, (ii) uma melhor resolução, e (iii) maior uniformidade espacial. Este método é especialmente útil para a determinação da massa exata de proteínas. O protocolo foi inicialmente desenvolvido e otimizado para a análise das proteínas da membrana e utilizado com sucesso para analisar os canais de íons, transportadores metabólito, e receptores, contendo entre 2 e 12 domínios transmembrana ^2. Desde a publicação original, também tem mostrado ser igualmente útil para a análise de proteínas solúveis. Na verdade, nós tê-lo usado para um grande número de proteínas tendo uma vasta gama de propriedades, incluindo aqueles com massas moleculares tão alto quanto 380 kDa ^3. Hoje é o nosso método de escolha para a análise de massa molecular de todas as proteínas. O procedimento descrito produz consistentemente de alta qualidade espectros, e é sensível, robusto e fácil de implementar.

Protocol

É muito importante usar luvas sem pó durante a preparação da camada fina.

Limpeza da placa de amostra

1. Use um aço inoxidável ou ouro placa amostra MALDI.
2. Lavar com MeOH e limpe delicadamente com um Kimwipe. Não esfregue ou esfregar a superfície com o Kimwipe, para evitar arranhar a superfície.
3. Lavar com H ₂ O e limpe delicadamente com um Kimwipe.
4. Lavar com MeOH e limpe delicadamente com um Kimwipe.
5. Se necessário, repita MeOH / H ₂ O ciclo de limpeza / MeOH, sempre terminando com MeOH.
6. Certifique-se que não há manchas fantasma ou resíduo restante no prato. Se houver manchas fantasma, lavar a placa com água deionizada, enquanto esfregando a superfície com a mão enluvada (Não esfregue com Kimwipes). Repita o MeOH / H ₂ O ciclo de limpeza / MeOH.
7. Use a placa imediatamente após a lavagem.

Preparação da solução fina camada de substrato

1. Misture 1 parte de saturada 4 HCCA (2 partes ACN, 1 parte de água, e 0,1% TFA final) e 3 partes de isopropanol.
   
   Nota: A solução de substrato em camada fina é muito estável, e pode ser mantido em temperatura ambiente no escuro durante um ano. Também pode ser armazenado a 4 ° C.

Fazendo a fina camada de substrato

1. Aplicar 20 50μL da solução de camada fina de substrato sobre o centro-esquerda do prato, e espalhar com o lado de uma ponta da pipeta. Varredura em uma direção.
2. Como a seca solução, a evaporação do solvente orgânico muito rapidamente, deixando para trás gotas minúsculas de água na superfície da placa. Neste ponto, enrole seu dedo indicador com uma camada de Kimwipe e inicialmente suavemente blot a superfície da placa com ele.
3. Quando a superfície está livre de pingos de água, limpe toda a placa com uni-direcional movimentos arrebatadores usando um Kimwipe.
   
   Nota: Se a solução não se espalhe o suficiente ao longo da superfície da placa, o aumento da composição ACN e recriar a camada fina. Alguns parâmetros que podem afetar a propagação da solução incluem umidade do ambiente e da temperatura.
   
   Nota: Com placas de ouro, a camada geralmente aparece como um reflexo amarelado, dependendo da visão e ângulos de luz. Com chapas de aço, apenas a borda da camada é normalmente visível.
   
   
4. Limpe as bordas do prato com um Kimwipe fresco antes de o colocar no suporte da placa para evitar a contaminação da matriz de instrumento.

Preparação da solução da matriz

1. Saturado de 4 HCCA em FWI (3 partes de ácido fórmico, 1 parte de água, 2 partes de isopropanol) é recomendada para análise de ambas as membranas e proteínas solúveis. Também pode ser usado em casos especiais para a análise de muito hidrofóbicas grandes peptídeos (M> 4.000 u). Certifique-se que a solução matriz utilizada para detectar as proteínas não exceda ~ 50% de conteúdo orgânico, uma vez que irá dissolver completamente o substrato camada fina, derrotando as vantagens do método.

Teste do substrato camada fina

1. 0.5μL local da solução matriz na placa. Um precipitado esbranquiçado aparecerá na interface entre a camada fina ea gota. Quando esta camada cobre o fundo da gota inteiramente, geralmente dentro de 10-15 segundos, aspirar o excesso de líquido com uma linha de vácuo. Se demorar mais de 30 segundos para o precipitado para formar, é uma indicação de que pode haver um problema com o substrato em camada fina e / ou a solução matriz.

Aplicação de exemplo

1. A concentração do analito nas soluções de partida deve ser no prazo de 10 e 1000μM.
2. Diluir a solução do analito em solução de matriz para uma concentração de analito final entre 0,2 e 2μM. Por exemplo, comece com 1μl de amostra e 9μl de solução matriz.
   
   Nota: Certifique-se que a matriz está perto de ser saturada na solução final, caso contrário você vai dissolver o substrato em camada fina.
   
   Nota: As concentrações do analito necessária para obter sinais decente são altamente dependentes da complexidade da solução e composição (por exemplo, contaminantes) e ionizability analito.
   
   Nota: Se uma única etapa de diluição não produz bons resultados, você deve tentar mais um passo de diluição. Embora contra-intuitiva, as soluções de analito altamente concentrada raramente produzem espectros bom.
   
   Nota: as proteínas da membrana geralmente requerem diluições maiores.
   
   
3. 0.5μl ponto de amostra / matriz mistura no prato. Um precipitado esbranquiçado formarão na interface entre a camada fina ea gota. Este precipitado é o cocrystallization da matriz e do analito. Quando esta camada cobre o fundo da gota inteiramente, usualiado dentro de 10-15 segundos, aspirar o excesso de líquido com uma linha de vácuo. Se demorar mais de 30 segundos para o precipitado para formar, pode ser uma indicação de um contaminante presente, o que impede a cristalização, ou o seu analito é muito concentrado.

Aplicação de calibração

1. Prepare a mistura de calibração / matriz de uma forma semelhante, com uma concentração final de calibração entre 0,1-0.5μM.
2. Local 0.5μl mistura de calibração / matriz sobre a placa em estreita proximidade com os pontos da amostra. Esta proximidade física é usado em um procedimento de calibração pseudo-internas no qual a placa é movido a partir do ponto de amostra para o ponto de calibração durante a aquisição da amostra, para adicionar um disparos de laser alguns dos calibradores para o espectro. Esta abordagem garante uma calibragem maior precisão do que massa de calibração externo.

Lavar passo

1. Lave cada local, com aproximadamente 2μL de uma solução de TFA 0,1% gelada aquosa. Aspirar o excesso de líquido com uma linha de vácuo.

Aquisição de espectros de massa

1. Agora você está pronto para adquirir espectros de massa. Se você usar a solução matriz FWI, você deve adquirir o seu espectro o mais rapidamente possível para impedir a modificação irreversível ao analito, tais como formylation.

Materials