Este vídeo demonstra a preparação de uma ultra-fina camada de matriz / analito para a análise de peptídeos e proteínas por Matrix Assisted Laser-ionização dessorção Espectrometria de Massa (MALDI-MS).
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Artigo de método
MALDI preparação da amostra: o método de Camada Ultra Thin
Neste artigo
Resumo
Resumo
Este vídeo demonstra a preparação de uma ultra-fina camada de matriz / analito para a análise de peptídeos e proteínas por Matrix Assisted Laser-ionização dessorção Espectrometria de Massa (MALDI-MS) 1, 2. O método de camada ultra-fina envolve a produção de uma camada de substrato de cristais de matriz (alfa-ciano-4-hidroxicinâmicos ácido) na placa de amostra, que serve como um campo de semeadura para a cristalização de uma mistura subseqüentes matriz / analito. Vantagens do método de camada ultra-fina sobre abordagens outra amostra de deposição (gotículas secas, por exemplo) são de que ele fornece (i) maior tolerância às impurezas tais como sais e detergentes, (ii) uma melhor resolução, e (iii) maior uniformidade espacial. Este método é especialmente útil para a determinação da massa exata de proteínas. O protocolo foi inicialmente desenvolvido e otimizado para a análise das proteínas da membrana e utilizado com sucesso para analisar os canais de íons, transportadores metabólito, e receptores, contendo entre 2 e 12 domínios transmembrana 2. Desde a publicação original, também tem mostrado ser igualmente útil para a análise de proteínas solúveis. Na verdade, nós tê-lo usado para um grande número de proteínas tendo uma vasta gama de propriedades, incluindo aqueles com massas moleculares tão alto quanto 380 kDa 3. Hoje é o nosso método de escolha para a análise de massa molecular de todas as proteínas. O procedimento descrito produz consistentemente de alta qualidade espectros, e é sensível, robusto e fácil de implementar.
Protocolo
É muito importante usar luvas sem pó durante a preparação da camada fina.
Limpeza da placa de amostra
- Use um aço inoxidável ou ouro placa amostra MALDI.
- Lavar com MeOH e limpe delicadamente com um Kimwipe. Não esfregue ou esfregar a superfície com o Kimwipe, para evitar arranhar a superfície.
- Lavar com H 2 O e limpe delicadamente com um Kimwipe.
- Lavar com MeOH e limpe delicadamente com um Kimwipe.
- Se necessário, repita MeOH / H 2 O ciclo de limpeza / MeOH, sempre terminando com MeOH.
- Certifique-se que não há manchas fantasma ou resíduo restante no prato. Se hou....
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Materiais
É fundamental que todos os reagentes são de alta qualidade (por exemplo, HPLC).
Luvas sem pó (látex ou nitrilo)
Aço inoxidável ou ouro placa amostra MALDI
Metanol (MeOH)
Água
Kimwipes
alfa-ciano-4-hidroxicinâmicos ácido (4-HCCA)
Trifluoroacético ácido (TFA) (concentração final em 0,1% em H 2 O)
Acetonitrila (ACN)
Ácido fórmico
Isopropanol
Referências
- Xiang, F., Beavis, R. C. A Method to Increase Contaminant Tolerance in Protein Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization by the Fabrication of Thin Protein-Doped Polycrystalline Films. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 8, 199-204 (1994).
- Cadene, M., Chait, B. T.
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Reimpressões e permissões
