Extração de DNA a partir do Micróbios Gut da térmita (Zootermopsis Angusticollis) e Visualizing micróbios do intestino

Resumo

Este vídeo ilustra a técnica para a extração de DNA das espécies de micróbios residentes no intestino posterior de cupins. A preparação de uma lâmina de montagem molhada, o que é útil para visualizar a comunidade microbiana do intestino também é ilustrado, e um tour pela espécie ambiente rico intestino é dado.

Resumo

Cupins estão entre os poucos animais conhecidos por terem a capacidade de subsistir unicamente por madeira de consumo. O trato intestinal de cupins contém uma população microbiana densa e ricos em espécies que auxilia na degradação da lignocelulose predominantemente em acetato, o nutriente chave alimentando o metabolismo de cupins (Odelson & Breznak, 1983). Dentro destas populações microbianas são bactérias, archaea metanogênicas e, em alguns cupins ("menor"), eucarióticas protozoários. Assim, os cupins são sujeitos de pesquisa excelente para estudar as interações entre espécies microbianas ea inúmeras funções bioquímicas que desempenham em benefício de seus hospedeiros. A composição de espécies das populações microbianas nos intestinos de cupins, bem como os principais genes envolvidos em vários processos bioquímicos tem sido explorado através de técnicas moleculares (Kudo et al, 1998;. Schmit-Wagner et al, 2003;. Salmassi & Leadbetter, 2003). Essas técnicas dependem da extração e purificação de alta qualidade ácidos nucléicos a partir do ambiente do intestino de cupins. A técnica de extração descrita neste vídeo é uma compilação modificada de protocolos desenvolvidos para a extração e purificação de ácidos nucléicos a partir de amostras ambientais (Mor et al, 1994;. Berthelet et al, 1996;. Purdy et al, 1996;. Salmassi & Leadbetter, 2003;. Ottesen et al 2006) e que produz DNA a partir de material de cupim intestino posterior adequado para uso como modelo para a reação em cadeia da polimerase (PCR).

Protocolo

Síntese do procedimento para extração de DNA de cupins de todo o intestino:

1. Cupins frio no gelo, retire gut usando uma pinça estéril e estabilizar amostras intestino em buffer.
2. Homogeneizar amostras em PVPP / SDS / buffer fenol.
3. Extrair e purificar o DNA de lisado bruto usando colunas Dneasy Qiagen.

Protocolo:

1. No gelo, retire a coragem de cupins trabalhador casta usando uma pinça estéril.
2. Transferir imediatamente a coragem e conteúdo a uma estéril, livre de nuclease tubo contendo 50 mL gelada 1x biologia molecular grau tampão ....

Discussão

Em nossa experiência, o DNA extraído das comunidades microbianas de espécies de madeira alimentando-cupim como nevadensis Zootermopis é suficientemente puro para o modelo de PCR, após uma rodada de extração e purificação. No entanto, alguns cupins, tais como lixo-alimentação e no solo alimentando-espécie pode ter uma maior concentração de ácidos húmicos em seu conteúdo intestinal e pode exigir a purificação adicional de DNA microbiano intestinal. O rendimento de DNA total das entranhas de 5 trabalhadores nevadensis Z. está na faixa de 10-30.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
PVPP/SDS/fenol	Tampão			tampão de homogeneização
Kit DNeasy Tissue	Kit	Qiagen	77607	Utilizado de acordo com o protocolo para isolamento de DNA genômico de lisados brutos (Apêndice H, versão do manual do produto: julho de 2003)
TE	Tampão	Sigma-Aldrich	T9285	tampão 1x (1 mM Tris-HCl, 0,1 mM EDTA, pH 8,0) a partir do concentrado 100x
esferas de zircônia/sílica	Materiais	Biospec Products	11079101z	0,1 mm
PVPP	Reagente	Sigma-Aldrich	P6755	polivinilpolipirrolidona a 1% p/v preparada a partir do reagente seco como suspensão 1x em tampão TE
Zootermopsis nevadensis	Animal			cupins
SDS	Reagente	Sigma-Aldrich	L4390	solução a 20% de dodecilsulfato de sódio em água, a partir do reagente seco
Fenol	Reagente	Sigma-Aldrich	77607	saturado com TE, ~73%
MiniBeadbeater-8	Ferramenta	Biospec Products	963
BSS	Solução Tampão de Sais, pH 7,2			Formulação por litro: 2,5 g K2HPO4, 1,0 g KH2PO4, 1,6 g KCl, 1,4 g NaCl, 0,075 g CaCl, 1 g MgCl e 10 mL de uma solução 1 M de NaHCO3
AxioPlan-2	Micrôscópio	Carl Zeiss, Inc.		Equipado com objetiva de 40x, optivar de 1,6x e lentes oculares de 10x. As amostras foram observadas utilizando iluminação de contraste de fase