Quantificação de DNA dupla fita-breaks, com base em γH2AX focos tem se tornado uma ferramenta valiosa, especialmente na biologia da radiação, para a avaliação da radiossensibilidade de tecidos e os efeitos de compostos de radiação modificando. Aqui mostramos o uso de um teste de imunofluorescência para quantificação de γH2AX focos em amostras de tecido.
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Artigo de método
Quantificação de γH2AX Focos em amostras de tecido
Neste artigo
Resumo
Resumo
DNA double-strand breaks (LAP) são lesões particularmente letal e genotóxicas, que podem surgir tanto por processos endógenos (fisiológica ou patológica) ou por fatores exógenos, a radiação ionizante e compostos principalmente radiomimético. Fosforilação da variante histona H2A, H2AX, na serina-139 resíduos, na altamente conservada motivo SQEY C-terminal, formando γH2AX, é uma resposta inicial ao DNA de fita dupla-breaks
Protocolo
Tecidos
- Tecido pulmonar, embutidos em moldes de temperatura de corte ideal (OCT) composto de 4583, foi seccionado (5 mm) usando uma Leica CM 1950 criostato e montados em poli-L-lisina slides.
As amostras congeladas foram obtidos a partir Dr Simon Royce Research the Children Murdoch Institute. Tecido pulmonar foi obtido a partir Balb não tratada / c camundongos e de um modelo do rato de doenças crônicas das vias aéreas alérgicas que mostra muitas das características patológicas da asma humana 6. Experimentos em animais foram realizados de acordo com as diretrizes e regulamentos estabelecidos pelo Comitê de Ética....
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Discussão
Para os fins desta demonstração foram utilizados a partir de tecido pulmonar do rato não tratada Balb / c infectados e de um modelo do rato de doenças crônicas das vias aéreas alérgicas. Nós quantificada diferenças no número de focos por célula com médias um pouco maior observada no pulmão danificado em comparação com seções não tratada. Especificamente, a quantificação indicou 6,5 por focos / célula e 9,4 focos por célula / (contagem manual de 20 células por seção), no tecido não tratados e de tecido doença alérgica cr.......
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Divulgações
Não há conflitos de interesse declarados.
Agradecimentos
O apoio do Instituto Australiano de Ciência Nuclear e Engenharia é reconhecido. TCK foi o ganhador de prêmios AINSE. Lab Medicine epigenômico é suportado pelo National Health and Medical Research Council of Australia (566.559). LM é apoiada por Melbourne Research (University of Melbourne) e Biomedical Imaging bolsas complementares CRC. O apoio de Monash Micro Imaging (Drs. Stephen Cody e ISKA Carmichael) foi inestimável para este trabalho. MMT é grato pela assistência especializada e conselhos do Dr. Olga Sedelnikova do National Institutes of Health.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários | |
|---|---|---|---|---|
| Albumina Sérica Bovina (BSA) | Sigma-Aldrich | A7906 | O BSA (1%) é usado para bloquear qualquer ligação inespecífica de anticorpos. Os anticorpos primários e secundários são diluídos em BSA. | |
| PBS (sem Ca)2+ e Mg2+) | Invitrogen | 17-517Q | ||
| Composto OCT (Optimal Cutting Temperature) 4583 | Tissue-Tek | 4583 | ||
| Superfrost Plus | Lâminas Polysine | Menzel-Glaser | SF41296SP | Atrai eletrostaticamente seções de tecido congelado e reduz a necessidade de revestimentos e adesivos adicionais. |
| Tween 20 | Reagente | Calbiochem | 655205 | Tween 20 (0,5%) é um detergente utilizado para permeabilizar células |
| Triton X-100 | Reagente | Sigma-Aldrich | T8787 | Triton X-100 (0,1%) utilizado para permeabilizar células. |
| Paraformaldeído | Reagente | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Anti-fosfo-γH2AX (anticorpo policlonal de coelho) | Anticorpo Primário | Upstate, Millipore | 07-164 | Diluição do anticorpo primário (1:500) em BSA 1%. |
| Alexa Fluor 488 anticorpo secundário de cabra anti-coelho IgG (H+L) | Anticorpo Secundário | Invitrogen | A-11008 | Diluição do anticorpo secundário (1:500) em BSA 1% |
| Etanol (70%) | Thermo Fisher Scientific, Inc. | BSPEL316 | ||
| RNAse A | Reagente | Qiagen | 19101 | |
| Vectashield PI | Reagente | Vector Laboratories | H-1300 | Um meio de montagem à base de glicerol contendo iodeto de propídio (um corante nuclear vermelho). Este meio deve ser usado com uma lente de óleo que corresponda ao seu índice de refração. Observação: corante de DNA comumente utilizado: 4,6-diamidino-2-fenilindol di-hidrocloridrato (DAPI). Pode ser usado apenas com microscópios que possuam laser de excitação apropriado. |
| Mini PAP Pen | Invitrogen | 008877 | ||
| Lâminas de cobertura (22x50 mm) | Menzel-Glaser | CS2250100 | ||
| Pote Coplin, vidro | Grale Scientific P/L | 1771-OG | ||
| Bacia de Coloração | Grale Scientific P/L | V1991.99 | ||
| Zeiss LSM 510 Meta Confocal | Microscópio confocal | |||
| CM Leica 1950 Criostato | Leica Microsystems | |||
| Metamorph | Software para análise de imagens | Molecular Devices |
Referências
- Rogakou, E. P., Boon, C., Redon, C., Bonner, W. M. Megabase chromatin domains involved in DNA double-strand breaks in vivo. J. Cell Biol. 146, 905-916 (1999).
- Bonner, W. M. Gamma H2AX and cancer. Nature Reviews Cancer. 8 (12), 957-967 (2008).
- Dickey, J. S.
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Reimpressões e permissões
