Artigo de método
Mosquitos Anopheles stephensi são vetores da malária e da Índia que habitam em toda a Ásia. Este vídeo demonstra a técnica para a realização de microinjeções desta espécie com transgenes que conferem resistência à malária para o mosquito. Grande parte da metodologia demonstrada neste vídeo é aplicável às técnicas de microinjeção de outras espécies de mosquito.
A introdução de genes exógenos em genomas de mosquitos exige técnicas de microinjeção sob medida para as espécies de interesse específicos. Este protocolo de vídeo demonstra um método utilizado pelo laboratório de James para microinject constrói DNA em embriões de Anopheles stephensi para a geração de mosquitos transformada. Técnicas de preparação agulhas microinjeção, coleta e preparação de embriões e na execução da microinjeção são ilustradas.
Preparação antes da microinjeção:
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| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários | |
|---|---|---|---|---|
| Agulhas de quartzo para injeção | Sutter Instrument Co. | São preparadas com diâmetro externo de 1,0 mm, diâmetro interno de 0,70 mm e comprimento de 10 cm, puxando tubos capilares para formar uma ponta fina de 3-8 µm com um eixo de aproximadamente 100-300 mm no puxador de micropipetas. | ||
| Puxador de quartzo | Ferramenta | Sutter Instrument Co. | P-2000 | Configuração: Calor-275, Fil-3, Vel-38, Del-250, Pull-141 |
| Kit de plasmídeo EndoFree | Qiagen | |||
| Isopropanol | ||||
| Coluna Millex-GV | SLGV RO4 NL | para limpeza de DNA | ||
| Construto de DNA | 0,5 mg/mL | |||
| Plasmídeo auxiliar | 0,3 mg/mL | |||
| Solução de injeção | Tampão | Solução 1x: 5 mM KCl, 0,1 mM fosfato de sódio, pH 6,8 | ||
| Tampão isotônico | ver receita na seção do protocolo | |||
| Óleo de dessecação | Óleo Halocarbono 700:Óleo Halocarbono 27 (1:1). Misturar bem. Preparar com antecedência da microinjeção. | |||
| Sangue | para alimentar mosquitos | |||
| Anopheles stephensi | Animal | Mosquitos, machos e fêmeas. | ||
| Frascos de cultura de Drosophila | para postura de ovos | |||
| Placas de Petri | com tampão isotônico, para eclosão de embriões | |||
| Pincel fino | Sable nº 0000 | |||
| Papel Whatman 3MM | ||||
| Pinça nº5 | ||||
| Fita dupla face | ||||
| Microloader | Eppendorf | 5242 956.003 | ||
| Transjetor | Eppendorf | |||
| Microscópio | Leica Microsystems | com platina móvel e micromanipulador, ajustado em 10x de magnificação |
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