Name: Visualização dos Intermediários UV-induzida replicação em E. coli Usando bidimensional Análise Agarose-gel (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-21T16:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 36 s
Description: Aprenda a visualizar intermediários estruturais de DNA durante a replicação em E. coli após dano UV usando análise bidimensional em gel de agarose. Este método revela dinâmicas de reparo e acúmulo de intermediários em mutantes.

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Trabalho em nosso laboratório é apoiado pela concessão de CARREIRA MCB0551798 da National Science Foundation e conceder ÁREA R15GM86839 do NIGMS-NIH.

1. Crescimento e irradiação UV. <ol><li> 200μl de uma cultura fresca durante a noite contendo o plasmídeo pBR322 cultivadas em Davis meio 1 suplementado com glicose 0,4%, 0,2% casamino ácidos, e 10 mcg / ml timina (médio DGCthy) e 100 mg / ml ampicilina é peletizada. O pellet celular é então ressuspenso em meio DGCthy 200μl falta ampicilina e usada para inocular 20 ml de meio de DGCthy. </li><li> Culturas são cultivadas sem ampicilina seleção em uma incubadora de agitação a 37 ° C para um OD 600 de 0,5 (~ 5 x 10 8 células / ml). Crescimento sem ampicilina evita seleção contra intermediários de replicação anormal ou improdutivas que podem surgir em alguns mutantes. Além disso, se estiver usando luz UV para induzir a dano, a remoção da ampicilina da mídia é necessária, pois absorve fortemente nestes comprimentos de onda e escudos das células, reduzindo a dose efectiva de UV. </li><li> Trabalhando sob luzes amarelas, a cultura é colocada em um prato de 15 centímetros de diâmetro Petri sobre uma plataforma giratória para agitação. Nossas culturas são colocados a uma distância de uma lâmpada germicida de 15 watts, que produz uma taxa de exposição de ~ 1 J/m2/sec, que é medida usando um fotômetro UVC. Culturas são irradiados com 50 J/m2 e depois colocado imediatamente de volta para a agitação 37 ° C incubadora para a duração do experimento. Esta dose produz, em média, um ciclobutano pirimidina dímero cada 4,5 kb de ssDNA. A iluminação amarela impede fotorreativação reversão de dímeros de pirimidina ciclobutano por fotoliase. </li></ol> 2. DNA Isolation. <ol><li> Às vezes, quando os intermediários de replicação devem ser examinados, uma alíquota de 0,75 ml da cultura é colocada em 0,75 ml de tampão de gelo NET30 frio (100 mM NaCl, 10 mM Tris, pH 8,0, 30 mM EDTA) e colocados no gelo até o final do o curso do tempo. Nós normalmente executam um curso de tempo 90 minutos, com amostras examinadas em 0, 15, 30, 45, 60 e 90 minutos. O EDTA e temperatura fria serve para efetivamente parar a replicação e reparação por excisão de nucleotídeos. </li><li> Cada amostra é então peletizadas, ressuspenso em 150 mL de 1,5 mg / ml lisozima e 0,2 mg / ml RNaseA em TE (10 mM Tris, pH 8.0, 1 mM EDTA) e lisadas a 37 ° C por 20 min. Neste momento, 10μl de proteinase K (10mg/ml) e 10μl de sarkosyl 20% são adicionados e os de incubação é autorizado a continuar por 1 hr. Proteinase K e sarkosyl ajudar a liberar fragmentos de DNA que podem ser associados com a membrana ou proteínas antes da extração de fenol ocorre. Desde DNA ativamente replicando muitas vezes é obrigado a complexos de proteínas ou membrana, esta ajuda a aumentar o rendimento de fragmentos de replicação que são recuperados. </li><li> Amostras são então extraídos pela adição de 2 volumes de fenol, para cada amostra e os tubos são gentilmente invertidos por 5 minutos. Em seguida, 2 volumes de clorofórmio / álcool isoamílico (24 / 1) são adicionados e os tubos são suavemente invertido uma vez por 5 minutos. </li><li> As amostras são centrifugadas a 14.000 rpm em microcentrífuga por cinco minutos ea fase aquosa superior de cada amostra é retirada, e colocado em um novo tubo. Em seguida, 4 volumes de clorofórmio / álcool isoamílico (24 / 1) são adicionados, os tubos são gentilmente invertidos por 5 minutos, e centrifugadas novamente a 14.000 rpm por 5 minutos. </li><li> A fase superior, aquosa de cada amostra é então dialisadas para 1 hora de spotting 100μl de cada amostra em um disco de 47 milímetros mM Whatman 0,025 poros que flutua em 250 ml de 0,1 x TE num copo. Porque as estruturas replicando com regiões único fio ou pontos de ramificação são mais suscetíveis ao corte, que normalmente cortam nossas dicas de pipeta fora com uma lâmina de barbear para fazer a boca mais larga e minimizar as forças de cisalhamento. Em geral, pipetagem deve ser reduzido ao mínimo até que o DNA foi digerido com enzimas de restrição. </li><li> Cada amostra é então digerido com PvuII (New England Biolabs), que lineariza o plasmídeo apenas a jusante da origem de replicação. </li><li> Antes de carregar no gel de agarose, clorofórmio e 100μl 20μl de corante que contém carga 6X Cyanol Bromofenol Azul e Xileno são adicionados a cada amostra e mistos. Então, 40μl da fase aquosa contendo o corante de carregamento é carregado no gel. Para minimizar os vieses estruturais, artefatos estruturais e corte de DNA, este procedimento de isolamento não inclui quaisquer medidas para enriquecer a regiões único fio, precipitado, ou concentrar as amostras de DNA após a lise celular. </li></ol> 3. Gel 2D e Análise do sul. <ol><li> O 2-dimensional análise agarose-gel é modificado a partir do 3. Para a dimensão 1 º, as amostras de DNA restrito são executados através de um gel de agarose 0,4% em TBE 1X em 1V/cm. Um litro de solução de TBE 10X de ações contém: <ul><li> 108 g Tris Base de Dados </li><li> 55 g de ácido bórico </li><li> 40 ml de EDTA 0,5 M (pH 8,0) </li></ul></li><li> A lambda marcador tamanho Hind III é carregado na pista primeiro, depois as amostras são carregadas em cada outra pista. Que normalmente executa o primeiro dimension ~ 12-15 hrs. Pular faixas torna mais fácil para cortar as pistas fora para lançar na segunda dimensão. A baixa tensão e baixo percentual de agarose gel serve para separar os fragmentos de DNA principalmente com base em tamanho. </li><li> Para a segunda dimensão, pistas gel são cortados fora do gel primeira dimensão usando uma faca de açougueiro grandes. A primeira faixa que contém o marcador lambda III Hind pode ser corado com brometo de etídio. Usando o marcador lambda III Hind como um guia de culturas, e descartar a região do gel que é abaixo de onde o plasmídeo linearizado é esperado para ser executado. Sob essas condições, descobrimos que pBR322 linearizada corre ligeiramente acima da cyanol xileno mancha. </li><li> Para lançar a segunda dimensão, cada faixa é colocada horizontalmente na parte superior de um gel caster vazio. A solução de agarose 1,0% em TBE 1X é preparado e resfriado a 55 ° C. Neste momento, a solução é derramado em gel para lançar a segunda dimensão, certificando-se cobrir completamente as fatias de gel. Uma vez que o gel tem definido, ele é executado no 6.5V/cm em uma unidade de eletroforese, que permite o buffer para recircular. Normalmente, executar a segunda dimensão ~ 5,5-7 horas. A alta tensão e alta cento agarose gel efetivamente separa os fragmentos de DNA com base em sua forma, assim como o tamanho. Formas não-lineares funcionar mais lentamente através da segunda dimensão. </li><li> Eletroforese seguinte, o gel é então lavado em H 2 O, lavados duas vezes em 400ml de ácido clorídrico 0,25 m por 15 minutos, lavados com H 2 O;, e depois lavados duas vezes em 400 ml de NaOH 0,4 M por 30 minutos. O ácido lava servem para nick parcialmente as moléculas de DNA em fragmentos menores que a transferência de forma mais eficiente. Esta etapa é necessária devido ao grande tamanho e formas incomuns dos intermediários de replicação do DNA. </li><li> O DNA no gel é então transferido para uma Hybond N + nylon membrana 4. Usamos um sistema de transferência para baixo alcalino com NaOH 0,4. Brevemente, duas folhas de papel mata-borrão embebido em NaOH 0,4 M são colocados em uma grande pilha de toalhas de papel. A membrana de nylon também é embebido em NaOH 0,4 M e colocado em cima do mata-borrão. O gel é então cuidadosamente em camadas no topo desta, seguido por um outro pedaço de papel mata-borrão, umedecidas na solução de NaOH. Finalmente, um longo pedaço de papel mata-borrão molhado é em camadas na parte superior e suas duas extremidades são colocadas em um prato com 1 L de solução de NaOH 0,4 M para servir como um pavio. Normalmente, deixe a transferência de DNA para 12/06 horas. </li><li> A membrana de nylon é removido, lavado em 20-30 seg Buffer SSC 5X, e colocado em um frasco contendo solução de hibridização rolo Prehybridization 10.5ml. Então, a membrana é incubada a 42 ° C com rotação por mais de 6 horas. Solução Prehybridization: <ul><li> 5,0 ml formamida </li><li> 0,5 ml SDS 20% </li><li> 2,5 ml * 20X SSC </li><li> * 2,0 ml de 50X Denhardt </li><li> 0,5 ml de DNA de esperma de salmão (10mg/ml) * Receitas para SSC e Denhardt pode ser encontrada em 5 </li></ul></li><li> Durante o período prehybridization, 1 mg de pBR322 plasmídeo é marcado com 32P pela tradução nick acordo com o protocolo fornecido pela Roche alfa usando rotulados [32-P] dCTP-. A sonda marcada (100μl) é desnaturado pela incubação a 98 ° C por 10 minutos em um tubo de microcentrífuga com tampa de rosca, em seguida, colocada imediatamente no gelo. </li><li> A sonda desnaturada é adicionado a 5,9 ml de solução de hibridização, que contém: <ul><li> 3,0 ml formamida </li><li> 1,5 ml SSC </li><li> 1,0 ml H 2 O </li><li> 0,15 ml de 50X Denhardt </li><li> 0,10 ml SDS 20% </li><li> 0,15 ml 10mg/ml DNA do esperma de salmão </li></ul></li><li> A solução prehybridization é derramado da garrafa rolo ea solução de hibridação é derramado dentro A garrafa de rolo é então devolvido à 42 ° C incubadora e rodado por mais de 12hrs. </li><li> A solução de hibridação é derramado da garrafa rolo. Então, o blot é lavado 4 vezes por 20 minutos na garrafa de rolo com ~ 150 ml de uma solução de lavagem contendo SSC 0,5 X, SDS 0,1% a 42 ° C com rotação. </li><li> Após a última lavagem, a membrana é colocada em uma toalha de papel até que o líquido tem visivelmente desapareceu. A membrana é então envolto em cloreto de polivinil-plástico e expostos a uma tela phosphorimager. Nós visualizar e quantificar a radioatividade usando uma tempestade 840 e seu software associado ImageQuant. </li></ol> 4. Resultados representativos: <img src="/files/ftp_upload/2220/2220fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Intermediários de replicação do plasmídeo observada na presença e ausência de UV induzida por dano ao DNA. O padrão de migração de PvuII digerida pBR322 plasmídeo observado por 2D-agarose-gel análise é diagramado. Não-linear replicar plasmídeos executado como um fragmento de 4,4 kb linear. Plasmídeos replicar formulário em forma de Y estruturas que migram mais lento do que os fragmentos não-replicantes, devido à sua maior dimensão e nãoforma nlinear. Este padrão de migração formas um arco que se estende para fora da região linear para o bem. Após a irradiação UV, duplo Y ou X em forma de moléculas são observadas na região cone que migra mais lentamente do que o arco de Y em forma de moléculas. Um exemplo da análise do sul do gel 2D sondado com 32P-rotulados pBR322 é mostrado para as células imediatamente após a irradiação UV e 15 minutos após a irradiação UV (reproduzido com permissão do editor).

<ol><li>Davis, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Isolation+of+Biochemically+Deficient+Mutants+of+Bacteria+by+Means+of+Penicillin%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">The Isolation of Biochemically Deficient Mutants of Bacteria by Means of Penicillin.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 35, 1-10 (1949).</li>
<li>Courcelle, J., Donaldson, J. R., Chow, K. H., Courcelle, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+Damage-Induced+Replication+Fork+Regression+and+Processing+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">DNA Damage-Induced Replication Fork Regression and Processing in Escherichia coli.</a> Science. 299, 1064-1067 (2003).</li>
<li>Friedman, K. L., Brewer, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+replication+intermediates+by+two-dimensional+agarose+gel+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Analysis of replication intermediates by two-dimensional agarose gel electrophoresis.</a> Methods Enzymol. 262, 613-627 (1995).</li>
<li>Spivak, G., Hanawalt, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+damage+and+repair+in+specific+DNA+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22METHODS%3A+A+Companion+to+Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Determination of damage and repair in specific DNA sequences.</a> METHODS: A Companion to Methods in Enzymology. 7, 147-161 (1995).</li>
<li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSambrook%2C+J+%22Molecular+Cloning+-+A+laboratory+manual%22">Molecular Cloning - A laboratory manual</a>. , CSHL Press. Cold Spring Harbor. (2001).</li>
<li>Donaldson, J. R., Courcelle, C. T., Courcelle, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RuvABC+is+required+to+resolve+holliday+junctions+that+accumulate+following+replication+on+damaged+templates+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">RuvABC is required to resolve holliday junctions that accumulate following replication on damaged templates in Escherichia coli.</a> J Biol Chem. 281, 28811-28821 (2006).</li>
<li>Donaldson, J. R., Courcelle, C. T., Courcelle, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RuvAB+and+RecG+Are+Not+Essential+for+the+Recovery+of+DNA+Synthesis+Following+UV-Induced+DNA+Damage+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">RuvAB and RecG Are Not Essential for the Recovery of DNA Synthesis Following UV-Induced DNA Damage in Escherichia coli.</a> Genetics. 166, 1631-1640 (2004).</li>
<li>Chow, K. H., Courcelle, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RecO+Acts+with+RecF+and+RecR+to+Protect+and+Maintain+Replication+Forks+Blocked+by+UV-induced+DNA+Damage+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">RecO Acts with RecF and RecR to Protect and Maintain Replication Forks Blocked by UV-induced DNA Damage in Escherichia coli.</a> J Biol Chem. 279, 3492-3496 (2004).</li>
<li>Belle, J. J., Casey, A., Courcelle, C. T., Courcelle, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inactivation+of+the+DnaB+helicase+leads+to+the+collapse+and+degradation+of+the+replication+fork%3A+a+comparison+to+UV-induced+arrest%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Inactivation of the DnaB helicase leads to the collapse and degradation of the replication fork: a comparison to UV-induced arrest.</a> J Bacteriol. 189, 5452-5462 (2007).</li>
<li>Chow, K. H., Courcelle, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RecBCD+and+RecJ%2FRecQ+initiate+DNA+degradation+on+distinct+substrates+in+UV-irradiated+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Radiat+Res%22%5BJournal%5D)">RecBCD and RecJ/RecQ initiate DNA degradation on distinct substrates in UV-irradiated Escherichia coli.</a> Radiat Res. 168, 499-506 (2007).</li>
<li>Al-Hadid, Q., Ona, K., Courcelle, C. T., Courcelle, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RecA433+cells+are+defective+in+recF-mediated+processing+of+disrupted+replication+forks+but+retain+recBCD-mediated+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat+Res%22%5BJournal%5D)">RecA433 cells are defective in recF-mediated processing of disrupted replication forks but retain recBCD-mediated functions.</a> Mutat Res. 645, 19-26 (2008).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Resultados típicos obtidos a partir de células de tipo selvagem, na presença e ausência de UV induzida por danos são mostrados na Figura 1. Na ausência de danos, cerca de 1% do DNA total plasmídeo pode ser encontrado no arco Y quando as células estão crescendo rapidamente em fase exponencial. Após a irradiação, um aumento transitório no Y moléculas em forma é observado como garfos de replicação bloqueados acumular em locais danificados. Os intermediários em forma de X replicação também transitoriamente acumular e persis...

<table><tbody><tr><td>Um exemplo da análise Southern do gel 2D sonda</td><td>GE Healthcare</td><td>G15T8</td><td>Iluminação amarela</td></tr><tr><td>Lâmpada germicida de 15 &amp;mu;watt</td><td>Sylvania</td><td>F20T12/GO</td><td>Lâmpada UV</td></tr><tr><td>Medidor de intensidade UV Blak-Ray 254 nm</td><td>Daigger</td><td>EF28195T</td><td>Fotômetro UVC</td></tr><tr><td>Discos com poros de 0,025 &amp;mu;m</td><td>Whatman, GE Healthcare</td><td>VSWP04700</td><td>Discos de diálise flutuantes</td></tr><tr><td>PvuII</td><td>Fermentas</td><td>ER0632</td><td>Endonuclease de restrição</td></tr><tr><td>Kit de tradução com corte (nick-translation)</td><td>Roche Group</td><td>976776</td><td>Para produzir sonda marcada com 32P</td></tr><tr><td>Papel de transferência</td><td>Whatman, GE Healthcare</td><td>3030-704</td><td>Para transferência Southern</td></tr><tr><td>Membrana de náilon</td><td>GE Healthcare</td><td>RPN203S</td><td>Para transferência Southern</td></tr></tbody></table>

visualização dos intermediários uv-induzida replicação em e. coli usando bidimensional análise agarose-gel

Visualization of UV-induced Replication Intermediates in E. coli using Two-dimensional Agarose-gel Analysis

Replicação imprecisa na presença de danos no DNA é responsável pela maioria dos rearranjos celular e mutagênese observado em todos os tipos de células e é acreditado extensamente para ser diretamente associada ao desenvolvimento de câncer em seres humanos. Danos ao DNA, como a induzidas por radiação UV, severamente prejudica a capacidade de replicação para duplicar o modelo genômico com precisão. Uma série de produtos de genes foram identificados que são necessários quando a replicação de DNA encontros lesões no modelo. No entanto, um desafio restante foi para determinar como essas lesões proteínas processo durante a replicação<em&gt; In vivo</em&gt;. Usando Escherichia coli como um sistema modelo, descrevemos um procedimento no qual duas dimensões de análise agarose-gel pode ser usado para identificar os intermediários estruturais que surgem em plasmídeos replicar<em&gt; In vivo</em&gt; Seguinte UV induzida por dano ao DNA. Este procedimento tem sido utilizado para demonstrar que forquilhas de replicação bloqueada pelo UV induzida por danos sofrer uma reversão transitória que é estabilizado por RecA e produtos de genes associados com vários RecF o caminho. A técnica demonstra que esses intermediários de replicação são mantidas até que um tempo que se correlaciona com a remoção das lesões através de reparação por excisão de nucleotídeos e retoma a replicação.

Nós apresentamos um procedimento pelo qual duas dimensões de análise agarose-gel pode ser usado para identificar a estrutura de intermediários de replicação que ocorrer após a irradiação UV.

Visualização dos Intermediários UV-induzida replicação em E. coli Usando bidimensional Análise Agarose-gel

A replicação imprecisa na presença de danos ao DNA é responsável pela maioria dos rearranjos celulares e da mutagênese observados em todos os tipos celulares ...

O objetivo geral deste procedimento é visualizar os intermediários estruturais do DNA que ocorrem quando a replicação encontra lesões no DNA, utilizando análise em gel bidimensional. Isso é realizado primeiramente isolando o DNA de células em divisão ativa nas quais lesões que bloqueiam a replicação foram induzidas. Em seguida, a eletroforese em gel é usada para separar o DNA recuperado com base no tamanho.Em seguida, as faixas são recortadas e recolocadas horizontalmente em um segundo gel que separa ainda mais o DNA com base no tamanho e na forma. Por fim, a análise southern é utilizada para visualizar as estruturas de DNA associadas aos fragmentos de DNA em replicação em momentos anteriores e em diversos momentos após a introdução de danos induzidos por UV. Em última análise, este procedimento pode ser usado para demonstrar que a incapacidade de processar lesões no DNA em certos mutantes resulta no acúmulo de intermediários de reparo do DNA.Olá, meu nome é Arthur Ian. Sou do Laboratório Corella da Universidade Estadual de Portland. Olá, meu nome é Brand she, eu também sou do Laboratório Corella.Hoje vamos mostrar um procedimento para eletroforese em gel bidimensional. Utilizamos este procedimento em nosso laboratório para estudar intermediários da replicação e reparo do DNA. Então, vamos começar.Para iniciar este procedimento, cultive uma cultura de 200 microlitros de e coli contendo o plasmídeo PBR 3 22 em meio DGC thigh com ampicilina a 37 graus Celsius. O uso do meio DGC thigh minimiza a proteção contra UV. Após a incubação noturna, pelletize as células a 14.000 RRP M por 30 segundos.Em seguida, ressuspenda o pellet celular em 200 microlitros de meio DG C th sem ampicilina e inocular. 20 mililitros de meio DG C thigh para crescer culturas sem seleção por ampicilina. Em um incubador com agitação a 37 graus Celsius até uma DO 600 de 0,5, o que corresponde a cerca de cinco vezes 10 à oitava células por mililitro. O crescimento sem ampicilina evita a seleção contra intermediários de replicação anormais ou improdutivos que podem surgir em alguns mutantes.Além disso, se utilizar luz UV para induzir danos, a remoção da ampicilina do meio é necessária porque ela absorve fortemente nesses comprimentos de onda e atua como escudo, reduzindo a dose efetiva de UV enquanto as células estão em crescimento. Utilize um fotômetro UVC para determinar a distância de uma lâmpada germicida de 15 watts que produza uma taxa de exposição de aproximadamente um JUUL por metro quadrado por segundo.Os passos subsequentes devem ser realizados sob luz amarela, pois isso impedirá a reversão da foto-reativação dos dímeros de ciclo butano pirimidina pela fotoliase após a irradiação com UV. Assim que a densidade celular desejada for atingida, utilize uma pipeta para transferir o cultivo para uma placa de Petri de 15 centímetros de diâmetro sobre uma plataforma rotatória, a fim de garantir uma irradiação uniforme de toda a população celular. Em seguida, irradie os cultivos com 50 joules por metro quadrado e transfira-os imediatamente para um frasco estéril pré-aquecido, recolocando-os no incubador agitado a 37 graus Celsius.Durante todo o experimento, essa dose produz em média um dímero de ciclobutano por cada 4,5 quilobases de DNA de fita simples, em cada ponto temporal a ser analisado. Pipete um alíquota de 0,75 mililitro da cultura em 0,75 mililitros de tampão NET 30 gelado. O tampão NET 30 atua como tampão de parada, impedindo a replicação e a reparação por excisão de nucleotídeos de prosseguirem.Uma vez que o tampão de parada tenha sido adicionado, a amostra pode ser mantida em gelo até o final do curso temporal. Após o curso temporal, centrifugue cada amostra e ressuspenda os pellets. Em 150 microlitros de tampão de lise, lise as células a 37 graus Celsius por 20 minutos sem agitação.Como estruturas replicativas com regiões de fita simples ou pontos de ramificação são mais suscetíveis ao cisalhamento, corte as pontas das pipetas com uma lâmina de barbear para alargar a abertura e minimizar as forças de cisalhamento. Em geral, a pipetagem e a agitação devem ser mantidas no mínimo até que o DNA tenha sido digerido com enzimas de restrição; após a lise, adicione proteinase K e célula sarcosina e permita que a incubação prossiga por uma hora. Isso serve para liberar fragmentos de DNA associados a proteínas.Como o DNA em replicação ativa geralmente está ligado a complexos proteicos ou de membrana, isso ajuda a aumentar o rendimento dos fragmentos de replicação. Após uma hora, extraia as amostras adicionando dois volumes de fenol a cada amostra e invertendo suavemente os tubos por cinco minutos. Em seguida, adicione dois volumes de clorofórmio, isoamil, álcool e inverta suavemente os tubos por mais cinco minutos.Em seguida, centrifugue as amostras a 14.000 RPM em uma microcentrífuga por cinco minutos e transfira a fase aquosa superior de cada amostra para um tubo novo. Em seguida, adicione quatro volumes de álcool ISO clorofórmico e, novamente, inverta suavemente os tubos por cinco minutos. Centrifugue as amostras novamente a 14.000 RPM por cinco minutos.Coloque uma membrana de diálise sobre 250 mililitros de 0,1 xte em um béquer e aplique 100 microlitros de cada amostra sobre a membrana. Deixe as amostras em diálise por uma hora após a diálise. Transfira 80 microlitros de cada amostra para um tubo novo de 1,5 mililitro contendo 20 microlitros da mistura enzimática.Digira as amostras durante a noite a 37 graus Celsius. PV dois lineariza o plasmídeo logo após a origem de replicação. Antes de carregar o gel de agarose, adicione 100 microlitros de clorofórmio e 20 microlitros de corante de carregamento 6x contendo bromo.Fenol azul e xileno ciano em cada amostra e misture clorofórmio irá remover qualquer PV dois ainda ligado às extremidades do DNA. Inicie a análise em gel de agarose bidimensional executando as amostras de DNA digerido através da primeira dimensão. Primeiro, carregue um marcador de tamanho Lambda hind três na primeira fileira de um gel de agarose 0,4% previamente preparado em 1x TBE.Em seguida, carregue 40 microlitros da fase aquosa contendo o corante de carregamento para cada amostra, pulando canais para facilitar o corte do gel. Após a eletroforese, execute a primeira dimensão a um volt por centímetro durante aproximadamente 12 a 15 horas. A baixa voltagem e o gel de AGROS com baixa porcentagem servem para separar os fragmentos de DNA principalmente com base no tamanho.Após a conclusão da primeira dimensão, utilize uma faca grande de açougueiro para recortar a primeira faixa contendo o marcador Lambda Hind III e corar com brometo de etídio. Para a segunda dimensão, corte as faixas do gel utilizando a faca grande de açougueiro, tomando como referência o marcador Lambda Hind III para o corte, e descarte a região abaixo da posição onde se espera que o plasmídeo linearizado migre em cada faixa. Para montar a segunda dimensão, posicione cada fatia horizontalmente ao longo da parte superior de um molde de gel vazio.Prepare uma solução de 1% de AROS em um XTBE e resfrie até 55 graus Celsius. Após o resfriamento, despeje a solução do gel para moldar a segunda dimensão, certificando-se de cobrir completamente as fatias do gel. É importante garantir que as fatias estejam uniformemente orientadas e que o molde esteja nivelado antes de despejar o gel.Uma vez que o gel tenha solidificado, realize a segunda dimensão por cinco horas e meia a sete horas a 6,5 volts por centímetro em uma unidade de eletroforese que permita a recirculação do tampão; o gel de agarose de alta voltagem e alto porcentual separa efetivamente os fragmentos de DNA com base em sua forma, bem como em seu tamanho. Formas não lineares migram mais lentamente pela segunda dimensão após a eletroforese. Enxágue o gel em água uma vez e, em seguida, lave-o duas vezes em 400 mililitros de ácido clorídrico 0,25 molar por 15 minutos com agitação suave.As lavagens ácidas têm a função de quebrar parcialmente as moléculas de DNA em fragmentos menores, que se transferem com maior eficiência durante a análise southern, sendo necessárias devido ao grande tamanho e à forma incomum dos intermediários da replicação do DNA. Para preparar o gel para a transferência alcalina, enxágue novamente o gel com água e, em seguida, lave-o duas vezes em 400 mililitros de hidróxido de sódio 0,4 molar por 30 minutos. O DNA nos géis é então transferido para uma membrana de nylon high bond n plus utilizando um sistema de transferência alcalina descendente com hidróxido de sódio 0,4 molar, conforme descrito na parte escrita deste procedimento. Deixe a transferência do DNA ocorrer por seis a 12 horas; após a transferência do DNA, prossiga com a hibridização da sonda conforme descrito no protocolo escrito.Após a membrana ter sido sonda e lavada, coloque a membrana sobre uma toalha de papel até que o líquido tenha desaparecido visivelmente. Em seguida, enrole a membrana em filme plástico de cloreto de polivinila e exponha-a a uma tela de imagem de fósforo. Por fim, a radioatividade pode ser visualizada e quantificada usando um Storm 840 e seu software ImageQuant associado.O padrão de migração do plasmídeo PBR 322 digerido por PV duas observado por análise em gel 2D de arco é esquematizado. Plasmídeos lineares não replicantes migram como um fragmento linear de 4,4 kb; plasmídeos replicantes formam estruturas em forma de Y que migram mais lentamente do que os fragmentos não replicantes devido ao seu maior tamanho e forma não linear. Esse padrão de migração forma um arco que se estende a partir da região linear em direção ao poço após irradiação por UV.Moléculas em formato duplo Y ou X são observadas na região do cone e migram mais lentamente do que o arco de moléculas em formato Y. Um exemplo da análise southern do gel 2D sonda com PBR 322 marcado com P 32 é mostrado para células imediatamente após a irradiação com UV e 15 minutos após a irradiação com UV imediatamente após a irradiação com UV. Aproximadamente 1% do DNA plasmidial total pode ser encontrado no arco Y quando as células estão se dividindo rapidamente na fase exponencial após uma radiação.Observa-se um aumento transitório de moléculas em forma de YS quando as forquilhas de replicação bloqueadas se acumulam em sítios danificados. Os intermediários de replicação em forma de L também se acumulam de maneira transitória e persistem até um momento que se correlaciona com o reparo das lesões. Acabamos de mostrar como visualizar intermediários de reparo do DNA utilizando eletroforese em gel bidimensional.Ao realizar este procedimento, é importante estar atento às forças de cisalhamento que podem reduzir o rendimento e tratar com cuidado todas as amostras e géis. É isso aí. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.

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JoVE Journal

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Biologia

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