Visualização dos Intermediários UV-induzida replicação em E. coli Usando bidimensional Análise Agarose-gel

O objetivo geral deste procedimento é visualizar os intermediários estruturais do DNA que ocorrem quando a replicação encontra lesões de DNA usando análise de gel bidimensional. Isso é feito isolando primeiro o DNA das células em divisão ativa nas quais as lesões bloqueadoras de replicação foram induzidas. Em seguida, a eletroforese em gel é usada para separar o DNA recuperado com base no tamanho.

Em seguida, as faixas são cortadas e reformuladas horizontalmente em um segundo gel que separa ainda mais o DNA com base no tamanho e na forma. Finalmente, a análise do sul é usada para visualizar as estruturas de DNA associadas à replicação de fragmentos de DNA em momentos antes e em vários momentos após a introdução de danos induzidos por UV. Em última análise, este procedimento pode ser usado para mostrar que a incapacidade de processar lesões de DNA em certos mutantes resulta no acúmulo de intermediários de reparo de DNA.

Olá, meu nome é Arthur Ian. Eu sou do Corella Lab da Portland State University. Olá, meu nome é Brand she, também sou do Corella Lab.

Hoje vamos mostrar um procedimento para eletroforese em gel bidimensional. Usamos esse procedimento em nosso laboratório para estudar a replicação do DNA e reparar intermediários. Então vamos começar.

Para iniciar este procedimento, cultive uma cultura noturna de 200 microlitros de e coli contendo o plasmídeo PBR 3 22 em meio de coxa DGC com ampicilina a 37 graus Celsius. O uso de DGC meio de coxa minimiza a proteção UV. Após a incubação durante a noite, as células a 14.000 RRP M por 30 segundos.

Em seguida, ressuspenda o pellet celular em 200 microlitros de meio DG C th sem ampicilina e inocule. 20 mililitros de meio DG C de coxa cultivam culturas sem seleção de ampicilina. Em uma incubadora agitada a 37 graus Celsius para um OD 600 de 0,5, o que corresponde a cerca de cinco vezes 10 elevado às oitavas células O crescimento por mililitro sem ampicilina evita a seleção contra intermediários de replicação anormais ou improdutivos que podem surgir em alguns mutantes.

Além disso, se estiver usando luz UV para induzir danos, a remoção da ampicilina do meio é necessária porque ela absorve fortemente nesses comprimentos de onda e escudos. As células reduzem a dose efetiva de UV enquanto as células estão crescendo. Use um fotômetro UVC para determinar a distância de uma lâmpada germicida de 15 watts que produz uma taxa de exposição de aproximadamente um JUUL por metro quadrado por segundo.

As etapas subsequentes devem ser executadas sob luz amarela, pois isso evitará a reversão da fotorreativação dos dímeros de ciclobutano perino por fotoligação após irradiação UV. Uma vez atingida a densidade celular desejada, use uma pipeta para transferir a cultura para uma placa de Petri de 15 centímetros de diâmetro em uma plataforma rotativa para garantir a irradiação uniforme de toda a população de células. Em seguida, irradie as culturas com 50 joules por metro quadrado e transfira-as imediatamente para um frasco pré-aquecido estéril e coloque-as de volta na incubadora de 37 graus Celsius.

Durante o experimento, essa dose produz em média um dímero de perina de ciclobutano, a cada 4,5 quilobases de DNA de fita simples para cada ponto de tempo a ser examinado. Pipete uma alíquota de 0,75 mililitro da cultura em 0,75 mililitros de rede gelada 30. O tampão líquido 30 serve como um tampão de parada que impede que a replicação e o reparo por excisão de nucleotídeos prossigam.

Uma vez adicionado o buffer de parada, a amostra pode ser mantida no gelo até o final do curso do tempo. Após o curso de tempo pellet cada amostra e ressuspender os pellets. Em 150 microlitros de tampão de lise, ligue as células a 37 graus Celsius por 20 minutos sem agitação.

Como as estruturas replicantes com regiões de fio único ou pontos de ramificação são mais suscetíveis ao cisalhamento, corte as pontas da pipeta com uma lâmina de barbear para tornar a boca mais larga e minimizar as forças de cisalhamento. Em geral, a pipetagem e a agitação devem ser reduzidas ao mínimo até que o DNA tenha sido digerido com enzimas de restrição, após a lise, adicione proteinase K e células sarcas e deixe a incubação continuar por uma hora. Isso serve para liberar fragmentos de DNA associados à proteína.

Como o DNA replicante ativo geralmente está ligado a complexos de proteínas ou membranas, isso ajuda a aumentar o rendimento dos fragmentos de replicação. Após uma hora, extrair as amostras adicionando dois volumes de fenol a cada amostra e invertendo suavemente os tubos durante cinco minutos. Em seguida, adicione dois volumes de clorofórmio, isoamila, álcool e inverta suavemente os tubos por mais cinco minutos.

Em seguida, centrifugar as amostras a 14 000 RPM numa microcentrífuga durante cinco minutos e transferir a fase aquosa superior de cada amostra para um tubo novo. Em seguida, adicione quatro volumes de álcool ISO de clorofórmio e, novamente, inverta suavemente os tubos por cinco minutos. Centrifugar novamente as amostras a 14 000 rpm durante cinco minutos.

Coloque uma membrana de diálise sobre 250 mililitros de 0,1 xte em um béquer e coloque 100 microlitros de cada amostra na membrana. Deixe as amostras dialisarem por uma hora após a diálise. Coloque 80 microlitros de cada amostra em um tubo novo de 1,5 mililitro contendo 20 microlitros de mistura de enzimas.

Digerir as amostras durante a noite a 37 graus Celsius. PV dois lineariza o plasmídeo logo a jusante da origem da replicação. Antes de carregar o gel agros, adicione 100 microlitros de clorofórmio e 20 microlitros de seis corantes de carregamento contendo bromo.

Azul de fenol e xileno ciano para cada amostra e mistura de clorofórmio removerá qualquer PV restante ligado às extremidades do DNA. Comece a análise bidimensional do gel aros executando as amostras de DNA restritas através da primeira dimensão. Primeiro, carregue um marcador de três tamanhos Lambda na primeira pista de um gel 0,4% agros previamente preparado em um XTBE.

Em seguida, carregue 40 microlitros da fase aquosa contendo o corante de carregamento para cada amostra, pulando as pistas para facilitar o corte do gel. Após a eletroforese, execute a primeira dimensão a um volt por centímetro por aproximadamente 12 a 15 horas. O gel AGROS de baixa voltagem e baixa porcentagem serve para separar os fragmentos de DNA principalmente com base no tamanho.

Depois que a primeira dimensão for executada, use uma faca grande de açougueiro para cortar a primeira faixa contendo o marcador Lambda hind three e manchar com brometo de atherio. Para a segunda dimensão, corte as faixas de gel usando a faca de açougueiro grande usando o marcador Lambda Hind três como uma cultura guia e descarte a região abaixo de onde o plasmídeo linearizado deve correr em cada pista. Para lançar a segunda dimensão, coloque cada fatia horizontalmente na parte superior de um rodízio de gel vazio.

Prepare uma solução de 1% AROS em um XTBE e deixe esfriar a 55 graus Celsius. Depois de resfriado, despeje a solução de gel para moldar a segunda dimensão, certificando-se de cobrir completamente as fatias de gel. É importante garantir que as fatias estejam uniformemente orientadas e o nível da rícino antes de despejar o gel.

Uma vez que o gel tenha endurecido, execute a segunda dimensão, cinco horas e meia a sete a 6,5 vols por centímetro em uma unidade de eletroforese que permite que o tampão recircule a alta voltagem e alta porcentagem de gel Agros separa efetivamente os fragmentos de DNA com base em sua forma e tamanho. As formas não lineares correm mais lentamente pela segunda dimensão após a eletroforese. Enxágue o gel em água uma vez e depois lave-o duas vezes em 400 mililitros de ácido clorídrico 0,25 molar por 15 minutos com agitação suave.

As lavagens ácidas servem para cortar parcialmente as moléculas de DNA em fragmentos menores que se transferem com mais eficiência durante a análise do sul e são necessárias devido ao grande tamanho e formato incomum dos intermediários de replicação do DNA. Para preparar o gel para transferência de álcalis, enxágue o gel novamente em água e lave-o duas vezes em 400 mililitros de hidróxido de sódio 0,4 molar por 30 minutos. O DNA nos géis é então transferido para uma membrana de náilon n mais alta ligação usando um sistema de transferência alcalina descendente com hidróxido de sódio 0,4 molar, conforme descrito na parte escrita deste procedimento, deixe a transferência de DNA por seis a 12 horas após a transferência de DNA continuar com a hibridização da sonda, conforme descrito no protocolo escrito.

Depois que a membrana for sondada e lavada, coloque-a sobre uma toalha de papel até que o líquido desapareça visivelmente. Em seguida, enrole a membrana em filme plástico de cloreto de polivinila e exponha-a a uma tela de fosfo. Finalmente, a radioatividade pode ser visualizada e quantificada usando uma tempestade oito 40 e sua imagem quantitativa associada.

O padrão de migração do plasmídeo PBR 3 22 digerido por PV dois observado pela análise de gel aros 2D é diagramado. Os plasmídeos lineares não replicantes são executados como estruturas lineares em forma de Y em forma de plasmídeo replicante de fragmentos de 4,4 KB que migram mais lentamente do que os fragmentos não replicantes devido ao seu tamanho maior e forma não linear. Esse padrão de migração forma um arco que se estende da região linear em direção ao poço após a irradiação UV.

Moléculas duplas em forma de Y ou X são observadas na região do cone e migram mais lentamente do que o arco de moléculas em forma de Y. Um exemplo da análise sul do gel 2D sondado com P 32 marcado PBR 3 22 é mostrado para células imediatamente após a irradiação UV e 15 minutos após a irradiação UV imediatamente após a irradiação UV. Aproximadamente 1% do DNA plasmático total pode ser encontrado no arco Y quando as células estão crescendo rapidamente em fase exponencial após uma radiação.

Um aumento transitório nas moléculas em forma de YS é observado à medida que os garfos de replicação bloqueados se acumulam em locais danificados. Os intermediários de replicação em forma de L também transitoriamente, acumulam-se e persistem até um momento que se correlaciona com o momento em que as lesões são reparadas. Acabamos de mostrar como visualizar intermediários de reparo de DNA usando eletroforese em gel bidimensional.

Ao fazer este procedimento, é importante estar ciente das forças de cisalhamento que podem reduzir o rendimento e ser gentil com todas as amostras e géis. Então é isso. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.