Avaliação do papel da imunidade do hospedeiro na infecção por micobactérias usando um modelo de peixe-zebra

Resumo

Fonte: Luukinen, H., et al. Modelagem da tuberculose em peixes-zebra adultos infectados por Mycobacterium marinum . J. Vis. Exp. (2018).

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê local de cuidados com animais institucionais e pelo conselho veterinário JoVE.

1. Infecção Experimental por M. marinum com Injeção Intraperitoneal

1. Pipete uma gota de 5 μL da solução bacteriana diluída sobre um pedaço de filme parafilme e puxe a gota para uma agulha de insulina de 30 G.
2. Use peixes selvagens de 5–8 meses e peixes mutantes rag1−/−hu1999 para o experimento. Anestesiar peixes-zebra adultos na água do aquário com 0,02% de éster etílico de ácido 3-aminobenzóico (pH 7,0). Posicione o lado ventral do peixe para cima em uma fenda sobre um plástico úmido e espumado.
   NOTA: Peixes mutantes rag-/- não conseguem passar por recombinação somática e produzir células T e B funcionais.
3. Injete a agulha entre as nadadeiras pélvicas em um ângulo de aproximadamente 45°. Mantenha a agulha aberta para cima para observar que toda a abertura está dentro da cavidade abdominal. Injete lentamente a suspensão bacteriana e remova cuidadosamente a agulha.
   NOTA: Caso o traçador vermelho esteja vazando do peixe durante a injeção, exclua-o do experimento.
4. Imediatamente após a injeção, transfira o peixe para um aquário de recuperação com água fresca.
5. Colete amostras da suspensão bacteriana em placas 7H10 a cada 15 minutos da alíquota bacteriana em uso e incube a bactéria a 29 °C por 5 dias, verificando a dose de infecção contando as colônias nas placas.
6. Verifique regularmente o bem-estar dos peixes e eutanasie qualquer peixe com sintomas da infecção com concentração superior a 0,02% de éster etil do ácido 3-aminobenzóico (pH 7,0).
   NOTA: Aproximadamente, 7% dos peixes-zebra adultos infectados com 34 ± 15 CFU e 30% dos peixes-zebra infectados com 2029 ± 709 CFU terão apresentado sintomas até 8 semanas19. Os sintomas podem incluir natação anormal, falta de resposta ao toque, ofegante, edema ou desgaste visível.
7. Mantenha o peixe-zebra de acordo com os padrões comuns

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Mycobacterium marinum	Coleção de Cultura do Tipo Americano	ATCC 927
Ágar Middlebrock 7H10	BD, Thermo Fisher Scientific	11799042
Enriquecimento OADC de Middlebrock	BD, Thermo Fisher Scientific	11718173
Middlebrock 7H9 médio	BD, Thermo Fisher Scientific	11753473
Enriquecimento do ADC Middlebrock	BD, Thermo Fisher Scientific	11718173
Comprimidos de solução salina tamponada com fosfato (PBS)	Sigma-Aldrich	P4417-50TAB
Vermelho fenólico	Sigma-Aldrich	P3532
Agulha de 27 G	Henke Sass Wolf	4710004020
Seringa de 1 mL	Henke Sass Wolf	4010.200V0
Agulha de insulina Omnican 100 30 G	Braun	9151133
Éster etílico do ácido 3-aminobenzoico (pH 7,0)	Sigma-Aldrich	A5040