Isolamento e cultura de células da zona nefrogênica do rim do rato embrionárias

Resumo

Neste relatório nós descrevemos um método para o isolamento e cultura do nicho de células progenitoras do rim do rato embrionárias que podem ser usadas para estudar vias de sinalização que regulam tronco / progenitoras células do rim em desenvolvimento. Estas células em cultura são altamente acessível a pequenas moléculas e tratamento de proteínas recombinantes, e importante também para a transdução viral, que permite a manipulação eficiente das vias candidato.

Resumo

Desenvolvimento embrionário dos rins tem sido extensivamente estudado tanto como um modelo para a interação epitélio-mesenquimal em organogênese e conhecer melhor as origens da doença renal congênita. Mais recentemente, a possibilidade de direcção ingênua células-tronco embrionárias para destinos nefrogênica tem sido explorado no campo emergente da medicina regenerativa. Estudos genéticos no rato identificaram vários caminhos necessários para o desenvolvimento do rim, e um catálogo global da transcrição de genes do órgão foi recentemente gerado http://www.gudmap.org/ , proporcionando reguladores candidato inúmeras funções essenciais de desenvolvimento. Organogênese dos rins de roedores pode ser estudado em cultura de órgão, e muitos relatórios têm usado essa abordagem para analisar os resultados de qualquer aplicação de proteínas candidato ou derrubando a expressão de genes candidatos usando siRNA ou morpholinos. No entanto, a aplicabilidade da cultura de órgãos, para o estudo de sinalização que regula a haste / diferenciação de células progenitoras contra renovação no rim em desenvolvimento é limitado como órgãos de cultura contêm uma matriz de difusão compacto extracelular limitando de macromoléculas e partículas de vírus. Para estudar a sinalização celular eventos que influenciam a haste / nicho de células progenitoras no rim, temos desenvolvido um sistema de célula primária que estabelece a zona nefrogênica ou nicho de células progenitoras do desenvolvimento do rim vivo ex isoladamente o indutor da diferenciação epitelial. Usando a digestão enzimática limitada, as células da zona nefrogênica pode ser seletivamente liberada de desenvolver rins em E17.5. Após filtração, essas células podem ser cultivadas como uma monocamada irregular utilizando condições otimizadas. Análise gene marcador demonstra que essas culturas contêm uma distribuição de tipos de células característica da zona nefrogênica in vivo, e que mantêm a expressão do gene marcador apropriado durante o período de cultura. Estas células são altamente acessível a pequenas moléculas e tratamento de proteínas recombinantes, e importante também para a transdução viral, o que facilita muito o estudo do candidato-tronco / progenitoras efeitos regulador celular. Parâmetros de células biológicas básicas, como a proliferação e morte celular, bem como alterações na expressão de marcadores moleculares característicos de néfron tronco / progenitoras células in vivo pode ser utilizado com sucesso como os resultados experimentais. Trabalhos em curso no nosso laboratório, utilizando esta técnica celular romance principal objetivo de descobrir os mecanismos básicos que regem a regulação da auto-renovação versus diferenciação no néfron tronco / progenitoras das células.

Protocolo

1. Preparando Reagentes para Digestão Kidney

1. 1,5 ml de colagenase 0,25% A (w / v) e 1% de solução pancreatina digerir (w / v) serão necessários para a extração de células da zona nefrogênica (NZCs) de 8 E17.5 rins. Porque Pancreatina leva aproximadamente duas horas para dissolver em temperatura ambiente, o suficiente digerir solução para o maior número de rins embrionários esperado deve ser feita antes do experimento. Prepare digerir solução primeiramente adicionando 25 mg de colagenase A a 10 ml de fosfato de Dulbecco Buffered Saline (DPBS) em 15 ml claro, tubo de centrifugação estéril. É fundamental que o DPBS não contém cálcio ou magnésio como isso irá ....

Discussão

Neste protocolo, descrevemos um método para isolar e cultivar células da zona nefrogênica do rim embrionário. É o desenvolvimento de um método inicialmente publicado como parte de um estudo dos efeitos da BMP7 tratamento em células da zona nefrogênica (Blank et al., 2009). No estudo inicial, uma série de experimentos para caracterizar os tipos de célula representada dentro da população NZC foram realizados. Resumidamente, a purificação da NZCs dos repórteres genética para o estroma cortical (Foxd1 ^{+ / .......}

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Relojoeiro’s pinça n.º 5	Roboz Surgical Instruments Co.	RS-4905	2 pares necessários
Colagenase A	Grupo Roche	10 103 578 001	Usar máscara
Pancreatina porcina	Sigma-Aldrich	P8096	Usar máscara
DPBS com Ca, Mg	Lonza Inc.	17-513F	Com Mg && Ca
Soro bovino fetal (SBF)	BioWhittaker	14-901E
HBSS	GIBCO, da Life Technologies	14175
KSFM	GIBCO, da Life Technologies	10724-011	sem fatores de crescimento adicionados
L-Glutamina 200 mM	Sigma-Aldrich	G7513	Usar @ 1% v/v
PenStrep 10.000 U de penicilina / ml, 10 mg de estreptomicina / ml	Sigma-Aldrich	P4333	Usar @ 1% v/v
Fibronectina	BD Biosciences	356008	Fornecido como pó
placa de cultivo de 24 poços	Thermo Fisher Scientific, Inc.	142485	Nunclon
DPBS sem Mg && Ca	Lonza Inc.	17-512F
tubos de poliestireno de 5 mL	BD Biosciences	352235
DNase (1 U/μl)	Invitrogen	18068-015	4 μl por 1,5 ml
peneira de células de 40 mícrons	BD Biosciences	352235	com tampa e tubo
Paraformaldeído	Sigma-Aldrich	P6148	Usar @ 4 % p/v
Triton X100	VWR international	VW3929-2	Usar a 0,3 % v/v
PBS	Sigma-Aldrich	P3813	Fornecido em pó
Soro de jumento	Jackson ImmunoResearch	017-000-121	Usar @ 5 % v/v
Coelho anti-PAX2	Invitrogen	71-6000	Diluir 1:100
Coelho anti-β-gal	MP Biomedicals	559762	Diluir 1:200
Oregon Green 488 faloidina	Invitrogen	O7466	Diluir 1:200
Donkey anti coelho Alexa Fluor 568	Invitrogen	A10042	Diluir 1:200
DAPI	Invitrogen	D1306	Diluir 1:5000
Vectashield	Vector Laboratories	H-1000
Glicerol	EMD Millipore	GX0185-6	Misture 50 % com H2O
RNeasy Micro Kit	Qiagen	74004	Utilize "DNase em coluna" protocolo
Pipetas de transferência, 3 ml	BD Biosciences	357575