iCLIP - Transcriptoma-wide Mapeamento das Interações Proteína-RNA com a Resolução Nucleotide Individual

Resumo

O arranjo espacial de RNA-proteínas que se ligam em uma transcrição é um determinante-chave de regulação pós-transcricional. Por isso, desenvolvemos individuais de nucleotídeo crosslinking UV resolução e imunoprecipitação (iCLIP) que permite o mapeamento do genoma precisa dos sítios de ligação de uma proteína RNA-binding.

Resumo

A composição única e arranjo espacial de RNA-proteínas de ligação (RBPs) em uma transcrição orientar os diversos aspectos da pós-transcricional regra ^1. Portanto, um passo essencial para a compreensão transcrição regulação a nível molecular é obter informação sobre a posição dos sítios de ligação de RBPs ^2.

Proteína-RNA interações podem ser estudadas através de métodos bioquímicos, mas estas abordagens não tratam RNA obrigatório em seu contexto nativo celular. Tentativas iniciais de estudo da proteína-RNA complexos no seu ambiente celular empregada purificação de afinidade ou imunoprecipitação combinado com display diferencial ou análise de microarray (RIP-CHIP) ^3-5. Essas abordagens eram propensos a identificar interações indiretas ou não-fisiológicos ^6. A fim de aumentar a especificidade ea resolução posicional, uma estratégia referida como CLIP (UV cross-linking e imunoprecipitação) foi introduzida ^7,8. CLIP combina UV cross-linking de proteínas e moléculas de RNA com esquemas de purificação rigoroso incluindo eletroforese desnaturante em gel de poliacrilamida. Em combinação com as tecnologias de seqüenciamento de alto rendimento, CLIP provou como uma ferramenta poderosa para estudar a proteína-RNA interações em escala do genoma (referido como HITS CLIP CLIP-ou-seq) ^9,10. Recentemente, PAR CLIP foi introduzida que usa análogos ribonucleosídeo fotorreativas de cross-linking ^11,12.

Apesar da alta especificidade dos dados obtidos, os experimentos CLIP muitas vezes gerar bibliotecas de cDNA de complexidade seqüência limitada. Isto é em parte devido à quantidade restrita de co-purificada RNA e os dois ineficiente reações ligadura RNA necessários para a preparação da biblioteca. Além disso, os testes indicaram que a extensão de primer cDNAs muitos truncar prematuramente no reticulado ¹³ nucleotídeos. Tais cDNAs truncado são perdidos durante o protocolo padrão preparação CLIP biblioteca. Recentemente, desenvolveu iCLIP (individual de nucleotídeo CLIP resolução), que capta a cDNAs truncado, substituindo um dos passos ineficientes intermolecular ligadura RNA com uma mais eficiente circularização intramolecular cDNA (Figura 1) ^14. Importante, o seqüenciamento do cDNAs truncado fornece insights sobre a posição do site cross-link com resolução de nucleotídeos. Nós aplicado com sucesso para estudar iCLIP hnRNP organização partícula C em uma escala do genoma e avaliar o seu papel na regulação do splicing ^14.

Protocolo

1. UV ligação cruzada de cultura de tecidos de células

1. Remova a mídia e adicionar 6 ml gelada PBS para as células cultivadas em uma placa de 10 cm (o suficiente para três experimentos).
2. Retire a tampa e colocar no gelo. Irradiar uma vez com 150 mJ / cm ² a 254 nm.
3. Colheita das células por raspagem com um levantador de células.
4. Transferência de 2 ml de suspensão celular para cada uma das três microtubos. Giram em velocidade máxima por 10 segundos a 4 ° C para as células de pelotas, em seguida, remova o sobrenadante.
5. Snap-congelar as bolinhas de células em gelo seco e armazenar a -80 ° C até o uso.

2. Preparação do grânulo

1. Adicionar 100 ul de proteína A Dynabeads (Dynal, 100,02) por experimento para um microtubo fresco (Use Dynabeads proteína G para um mouse ou anticorpos de cabra).
2. Lavar contas 2x com tampão (50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 100 mM NaCl, 1% NP-40, 0,1% SDS; desoxicolato de sódio 0,5%; 1 / 100 de inibidores da protease cocktail III, Calbiochem) lise.
3. Ressuspender contas em 100 mL com tampão de lise 20-10 mg de anticorpos.
4. Gire tubos à temperatura ambiente por 30-60 min.
5. Lavar 3x com 900 mL tampão de lise e deixar na última lavagem, até estar pronto para avançar para o passo 4.1.

3. Lise celular e digestão parcial RNA

1. Ressuspender o pellet celular em um tampão de lise ml e transferir para 1,5 ml microtubos.
2. Prepare uma diluição de 1 / 500 da RNase I (Ambion, AM2295). Adicionar 10 ml de diluição RNase I, bem como 2 l Turbo DNase ao lisado celular (1 / 500 diluições RNase I [baixo RNase] são usados ​​para a preparação de biblioteca; 1 / 50 diluições [alta RNase] são necessárias para o controle para a especificidade de anticorpos) .
3. Incubar as amostras para exatamente 3 minutos a 37 ° C, agitando a 1.100 rpm. Transferir imediatamente para o gelo.
4. Girar a 4 ° C e 22.000 g por 20 min para limpar o lisado. Recolher com cuidado o sobrenadante (deixar cerca de 50 mL do lisado com a pelota).

4. Imunoprecipitação

1. Remova o tampão de lavagem dos grânulos (a partir do passo 2.5), em seguida, adicione o lisado de células (do passo 3.4).
2. Gire as amostras por 2 horas a 4 ° C.
3. Desprezar o sobrenadante e lavar as contas 2x com 900 buffer de alta-sal mL (50 mM Tris-HCl, pH 7,4; 1 M NaCl; 1 mM EDTA, 1% NP-40, 0,1% SDS, 0,5% desoxicolato de sódio).
4. Lavar 2x com 900 tampão de lavagem (20 mM Tris-HCl, pH 7,4, 10 mM MgCl _2; 0,2% Tween-20) mL.

5. Desfosforilação de RNA 3'ends

1. Descartar o sobrenadante e ressuspender as contas em 20 mix PNK mL (15 mL de água, 4 mL pH 6,5 PNK 5x buffer [350mMTris-HCl, pH 6,5; 50mMMgCl 25mMdithiothreitol _2], 0,5 mL da enzima PNK, 0,5 mL RNasin [Promega]).
2. Incubar por 20 min a 37 ° C.
3. Adicionar 500 mL de tampão de lavagem e lavar 1x com alto-sal buffer.
4. Lavar 2x com tampão de lavagem.

6. Ligadura vinculador a RNA 3 'termina

1. Remova cuidadosamente o sobrenadante e ressuspender as contas em 20 mix ligadura mL (9 mL de água, 4 mL de buffer ligadura 4x [200 mMTris-HCl; MM 40m GCL _2; 40 ditiotreitol mM]; 1 ml RNA ligase [NEB], 0,5 mL RNasin [Promega]; 1,5 linker pré-adenylated mL L3 [20 mM], 4 mL PEG 400 [81170, Sigma]).
2. Incubar durante a 16 ° C.
3. Adicionar 500 mL de tampão de lavagem e depois lavar 2x com um buffer de alta-sal ml.
4. Lavar 2x com 1 ml tampão de lavagem e deixar em 1 ml da segunda lavagem.

7. Rotulagem RNA extremidade 5 '

1. Remover o sobrenadante e ressuspender as contas em 8 mL de mistura quente PNK (0,4 mL PNK [NEB]; 0,8 mL ³² P-γ-ATP; 0,8 mL de buffer PNK 10x [NEB]; 6 mL de água).
2. Incubar por 5 min a 37 ° C.
3. Retire a mistura quente e PNK ressuspender as contas em 20 l de tampão de carregamento Nupage 1x (Invitrogen).
4. Incubar em um Thermomixer a 70 ° C por 10 min.
5. Coloque imediatamente em um ímã para precipitar as contas vazio e carregar o sobrenadante no gel (veja passo 8).

8. SDS-PAGE e transferência de membrana

1. Carregar as amostras em um NuPAGE 4-12% Bis-Tris gel (Invitrogen) de acordo com as instruções do fabricante. Use 0,5 l de tampão de corrida MOPS 1x (Invitrogen). Também carga de 5 mL de um marcador de tamanho pré-manchada de proteína (por exemplo PAGE governante plus, Fermentas, SM1811).
2. Executar o gel por 50 min em 180 V.
3. Remova o gel frente e descarte de resíduos sólidos (contém livre radioativos ATP).
4. Transferência dos complexos de proteína-RNA do gel para uma membrana de nitrocelulose utilizando o aparelho de transferência Novex húmida de acordo com as instruções do fabricante (Invitrogen, transferência de 1 hora a 30 V).
5. Após a transferência, lavar a membrana em tampão PBS, em seguida, envolvê-la em saran wrap e expô-la a um filme Fuji a -80 ° C (colocar um adesivo fluorescente próxima à membrana para depois alinhar tele cinema e da membrana; realizar exposições por 30 min, 1h e durante a noite).

9. RNA isolamento

1. Isolar os complexos de proteína-RNA a partir do experimento de baixo RNase usando o autoradiograph a partir do passo 8.5 como uma máscara. Corte este pedaço de membrana em várias fatias e coloque-os em um microtubo de 1,5 ml.
2. Adicionar 200 mL de buffer PK (100 mM Tris-HCl pH 7,4, 50 mM NaCl, 10 mM EDTA) e 10 ml proteinase K (Roche, 03115828001) para as peças de membrana. Incubar agitando a 1.100 rpm por 20 min a 37 ° C.
3. Adicionar 200 mL de tampão PKurea (100 mM Tris-HCl pH 7,4, 50 mM NaCl, 10 mM EDTA; 7 M uréia) e incubar por 20 min a 37 ° C.
4. Coletar a solução e adicioná-lo juntamente com 400 mL de RNA de fenol / clorofórmio (Ambion, 9722) para uma Fase 2 ml de bloqueio do tubo Gel pesados ​​(713-2536, VWR).
5. Incubar por 5 min a 30 ° C, agitando a 1.100 rpm. Separar as fases por fiação por 5 min a 13.000 rpm à temperatura ambiente.
6. Transferir a fase aquosa para um novo tubo (cuidado para não tocar no gel com a pipeta). Adicionar 0,5 mL glycoblue (Ambion, 9510) e 40 mL 3 M pH 5,5 e acetato de sódio mix. Em seguida, adicione 1 ml de etanol 100%, misture novamente e precipitar durante a noite a -20 ° C.

10. Transcrição reversa

1. Giro por 20 min a 15.000 rpm e 4 ° C. Remover o sobrenadante e lavar o pellet com 0,5 ml de etanol 80%.
2. Ressuspender o sedimento em 7,25 mL de RNA / mix de primer (6,25 mL de água, 0,5 mL de primer Rclip [0.5pmol/μl], 0,5 mL de dNTP mix [10mM]). Para cada experiência ou replicar, use um primer Rclip diferentes contendo seqüências de códigos de barras individuais (ver 14).
3. Incubar por 5 min a 70 ° C antes do resfriamento a 25 ° C.
4. Adicionar 2,75 mL RT mix (2 mL tampão RT 5x, 0,5 mL 0,1 M DTT; 0,25 mL Sobrescrito III da transcriptase reversa [Invitrogen]).
5. Incubar 5 min a 25 ° C, 20 min a 42 ° C, 40 min a 50 ° C e 5 min a 80 ° C antes do resfriamento a 4 ° C.
6. Adicionar 90 mL tampão TE, 0,5 mL glycoblue e 10 mL de acetato de sódio pH 5,5 e misturar. Em seguida, adicione 250 mL de etanol 100%, misture novamente e precipitar durante a noite a -20 ° C.

11. Purificação em gel de cDNA

1. Spin para baixo e lavar as amostras (ver 10.1), em seguida, voltar a suspender as pelotas em 6 mL de água.
2. Adicionar 6 mL de tampão de carregamento 2x TBE-uréia (Invitrogen). Amostras de calor a 80 ° C por 3 min directamente antes de carregar.
3. Carregar as amostras em um pré-moldado de 6% gel TBE-uréia (Invitrogen) e correr por 40 min a 180 V, conforme descrito pelo fabricante. Também carregar um marcador de baixo peso molecular de corte subseqüentes (veja abaixo).
4. Corte três bandas em 120-200 nt (alto), 85-120 nt (médio) e 70-85 nt (baixo). Use theupper dye e as marcas com o apoio gel de plástico para guiar a excisão (ver Figura 3). Note-se que o primer Rclip ea seqüência L3, juntos, respondem por 52 nt da seqüência CLIP.
5. Adicionar 400 mL de TE e esmagar a fatia de gel em pequenos pedaços usando uma um êmbolo da seringa ml. Incubar agitando a 1.100 rpm por 2 horas a 37 ° C.
6. Coloque dois um centímetro de vidro pré-filtros (Whatman, 1.823.010) em uma coluna Spinx Costar (Corning Incorporated, 8161). Transferir a parte líquida da amostra para a coluna. Rodada por 1 min a 13.000 rpm em um tubo de 1,5 ml.
7. Adicionar 0,5 mL glycoblue e 40 mL de acetato de sódio pH 5,5, em seguida, misturar a amostra. Adicionar 1 ml de etanol 100%, misture novamente e precipitar durante a noite a -20 ° C.

12. Ligadura de primer para o 5'end do cDNA

1. Spin para baixo e lavar as amostras (ver 10.1), em seguida, voltar a suspender as pelotas em 8 mix ligadura mL (6,5 mL de água e 0,8 mL 10x CircLigase buffer II; 0,4 mL 50 mM MnCl _2; 0,3 mL; Circligase II [Epicentre]) e incubar por 1 hora a 60 ° C.
2. Adicionar 30 mL de recozimento mix oligo (26 mL de água, 3 mL de buffer FastDigest [Fermentas]; 1 ml cut_oligo [10 mM]). Incubar por 1 min a 95 ° C. Então diminuir a temperatura a cada 20 segundos em 1 ° C até 25 ° C são atingidos.
3. Adicione 2 mL BamHI (Fermentas Fast) e incubar por 30 min a 37 ° C.
4. Adicionar 50 mL TE e 0,5 glycoblue mL e misturar. Adicionar 10 mL de acetato de sódio pH 5,5 e misture, em seguida, adicione 250 mL de etanol 100%. Misture novamente e precipitar durante a noite a -20 ° C.

13. Amplificação por PCR

1. Spin para baixo e lavar as amostras (ver 10.1), em seguida, ressuspender o sedimento em 19 mL de água.
2. Prepare a mistura de PCR (19 mL cDNA; 1 ml de primer mix P5/P3 Solexa, 10 mM cada; 20 mL Accuprime Supermix uma enzima [Invitrogen]).
3. Execute o programa de PCR seguinte: 94 ° C por 2 min, [94 ° C por 15 segundos, 65 ° C por 30 segundos, 68 ° C por 30 segundos] _{25-35 ciclos,} 68 ° C por 3 min, 4 ° C para sempre.
4. Mix 8 mL do produto PCR com 2 l de tampão TBE 5x de carga e de carga em um gel TBE pré-moldado de 6% (InvitRogen). Manchar o gel com Sybrgreen I (Invitrogen) e analisar com um gerador de imagens gel.
5. O código de barras na primers Rclip permitem amostras multiplex diferente antes de enviar para o seqüenciamento de alto rendimento. Apresentar 15 mL da biblioteca para o seqüenciamento e armazenar o resto.

14. Seqüências Linker e primer

DNA linker pré-adenylated 3 ':

[Nós fim do adaptador de DNA a partir de IDT e fazer alíquotas de 20Hm.]

15. Resultados representativos:

Antes de seqüenciamento da biblioteca iCLIP, o sucesso do experimento pode ser monitorado em duas etapas: a autoradiograph do complexo proteína-RNA após a transferência de membrana (passo 8.5) ea imagem gel dos produtos de PCR (passo 13.4). No autoradiograph das amostras de baixa RNase, a radioactividade difusa deve ser visto acima do peso molecular da proteína (Figura 2, amostra 4). De alta RNase amostras, a radioatividade é focado mais perto do peso molecular da proteína (Figura 2, amostra 3). Quando não há anticorpo é usado no imunoprecipitação, nenhum sinal devem ser detectados (Figura 2, as amostras 1 e 2). Mais importantes controles para a especificidade da imunoprecipitação ou omitir irradiação UV ou células uso que não expressam a proteína de interesse ^14.

A imagem do gel dos produtos de PCR (passo 13.4) deve mostrar uma faixa de tamanho que corresponde à fração de cDNA (alta, média ou baixa) purificada no passo 11.4 (Figura 4, faixas 4-6). Note que a PCR e primers P3Solexa P5Solexa introduzir um nt 76 adicionais para o tamanho do cDNA. Se nenhum anticorpo é usado durante a imunoprecipitação, nenhum produto correspondente PCR devem ser detectados (Figura 4, faixas 1-3). Produto dímero Primer pode aparecer em cerca de 140 nt.

Para obter resultados representativos de high-throughput seqüenciamento e posterior análises de bioinformática ver ^14.

Figura 1. Representação esquemática do protocolo iCLIP. Proteína-RNA complexos são covalentemente cruzada in vivo utilizando irradiação UV (passo 1). A proteína de interesse é purificado, juntamente com o RNA ligado (passos 2-5). Para permitir priming seqüência específica de transcrição reversa, um adaptador de RNA é ligada à extremidade 3 'do RNA, enquanto que a extremidade 5' é marcado radioativamente (passos 6 e 7). Cross-linked proteína-RNA complexos são purificados a partir de RNA livre usando SDS-PAGE e transferência de membrana (passo 8). O RNA é recuperado a partir da membrana por digerir a proteína com proteinase K deixando um polipeptídeo remanescente no cross-link nucleotídeo (passo 9). Transcrição reversa (RT) trunca no polipeptídeo restantes e apresenta duas regiões adaptador clivável e sequências de código de barras (passo 10). Seleção de tamanho remove cartilha RT livre antes de circularização. A linearização seguir gera modelos adequados para a amplificação PCR (passos 11-15). Finalmente, high-throughput seqüenciamento gera lê na qual as seqüências de códigos de barras são imediatamente seguidos por último nucleotídeo do cDNA (passo 16). Uma vez que este nucleotídeo localiza uma posição a montante do nucleotídeo cruzada, o sítio de ligação pode ser deduzida com alta resolução.

Figura 2. Autoradiograph de cross-linked hnRNP C-RNA complexos usando eletroforese em gel desnaturante e transferência de membrana. hnRNP C-RNA complexos foram imuno-purificada a partir de extratos de células usando um anticorpo contra hnRNP C (α hnRNP C, as amostras 3 e 4). RNA foi parcialmente digeridos com baixa (+) ou alta (+ +) concentração de RNase. Complexos deslocando para cima a partir do tamanho da proteína (40 kDa) pode ser observado (amostra 4). A mudança é menos pronunciado quando altas concentrações de RNase foram utilizados (amostra 3). O sinal radioativo desaparece quando não há anticorpos foi utilizado no imunoprecipitação (amostras 1 e 2).

Figura 3. Esquemática 6% gel TBE-uréia (Invitrogen) para guiar a excisão de produtos iCLIP cDNA. O gel é executado por 40 min a 180 V levando a um padrão de migração reprodutível de cDNAs e corantes (luz e azul escuro) no gel. Use uma lâmina de barbear para cortar (linha vermelha) a alta (H), médio (M) e baixa (L) frações cDNA. Comece por cortar no meio do corante azul e imediatamente acima da marca na fita gel de plástico. Divide as frações de média e baixa e aparar a fração alta de cerca de 1 cm acima do corante azul claro. Use cortes verticais guiada pelo bolsos e o corante para separar as pistas diferentes (neste exemplo, 1-4). A pista marcador (m) pode ser manchado e fotografada para controlartamanhos após o corte. Tamanhos de fragmentos são indicados à direita.

Figura 4. Análise de bibliotecas amplificado por PCR usando cDNA iCLIP eletroforese em gel. RNA recuperado da membrana (Figura 1) foi reverso transcrito e tamanho purificado utilizando eletroforese em gel desnaturante (Figura 2). Três frações de tamanho de cDNA (alta [H]: 120-200 nt, média [M]: 85-120 nt e de baixo [L]: 70-85 nt) foram recuperados, enviou notícias, re-linearizado e amplificado por PCR. Os produtos de PCR de distribuição de tamanho diferente pode ser observada como resultado dos tamanhos diferentes das frações de entrada. Uma vez que o primer PCR apresenta 76 nt para o cDNA, tamanhos deve variar entre 196-276 nt para alto, 161-196 nt para empresas de médio e 146-161 nt para frações tamanho reduzido. Os produtos de PCR estão ausentes quando nenhum anticorpo foi utilizado para a imunoprecipitação (faixas 1-3).

Discussão

Desde o protocolo iCLIP contém uma gama diversificada de reações enzimáticas e etapas de purificação, nem sempre é fácil identificar um problema quando um experimento falhar. No fim de controlar a especificidade da RNA identificados cross-link sites, um ou mais controles negativos deve ser mantida durante todo o experimento completo e subseqüentes análises computacionais. Esses controles podem ser a amostra não-anticorpo, as células não-cross-linked, ou imunoprecipitação a partir de células ou tecidos knockout. Idealmente, estes experimentos de controle não deve purificar quaisquer complexos de proteína-RNA, e, portanto, deve dar nenhum sinal sobre o gel SDS-PAGE, e nenhum produto detectável após a amplificação PCR. Alto rendimento de sequenciamento dessas bibliotecas controle deve retornar muito poucas seqüências únicas. Knockdown células não são recomendadas como um controle de sequenciamento, uma vez que as seqüências resultantes ainda correspondem a cross-link-sites da mesma proteína, que é purificada a partir de células knockdown em quantidades menores.

Precauções devem ser tomadas para evitar a contaminação com produtos de PCR a partir de experiências anteriores. A melhor maneira de minimizar este problema é espacialmente separadas as etapas pré e pós-PCR. Idealmente, a análise dos produtos de PCR e todas as etapas subseqüentes devem ser realizados em uma sala separada. Além disso, cada membro do laboratório deve usar seu próprio conjunto de buffers e outros reagentes. Desta forma, as fontes de contaminação pode ser mais fácil identificar.

Materiais

Nome do reagente	Companhia	Catálogo #	Comentários
A proteína Dynabeads	Invitrogen	10001D	utilização da proteína G para o anticorpo do rato ou de cabra
RNase I	Ambion	AM2295	atividade pode mudar de lote para lote
T4 RNA ligase I	NEB	M0204S
PNK	NEB	M0201S
proteinase K	Roche	03115828001
Sobrescrito III da transcriptase reversa	Invitrogen	18080044
Circligase II	Epicentro	CL9021K
FastDigest ® BamHI	Fermentas	FD0054
AccuPrime ™ Supermix I	Invitrogen	12342010	esta mistura PCR dá os melhores resultados em nossas mãos