Nosso grupo desenvolveu um sistema de cultura biorreator que imita as tensões pulsátil fisiológica do sistema cardiovascular para regenerar implantáveis de pequeno diâmetro enxertos vasculares.
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Artigo de método
Engenharia Biológica Baseado em enxertos vasculares Usando um biorreator pulsátil
Neste artigo
Resumo
Resumo
Muito esforço tem sido dedicado a desenvolver e fazer avançar a metodologia para regenerar funcional de pequeno diâmetro arterial ignora. No ambiente fisiológico, tanto a estimulação mecânica e química são necessários para manter o bom desenvolvimento e funcionalidade de 1,2 vasos arteriais.
Sistemas de cultura biorreator desenvolvido pelo nosso grupo são projetados para suportar a regeneração navio dentro de um ambiente controlado com precisão químico-mecânico que imita a de vasos nativos. Nossa assembléia biorreator e procedimentos de manutenção são bastante simples e altamente repetitivo 3,4. Células musculares lisas (PMEs) são semeados em um ácido poliglicólico tubular (PGA) de malha que é rosqueado ao longo tubo de silicone compatível e cultivadas em biorreator, com ou sem estimulação pulsátil por até 12 semanas. Há quatro principais atributos que distinguem o nosso biorreator de alguns antecessores. 1) Ao contrário dos sistemas outra cultura que simulam apenas o bioquímico em torno dos vasos sanguíneos nativo, nosso biorreator também cria um ambiente fisiológico pulsátil, aplicando tensão radial cíclica para os vasos em cultura. 2) Várias embarcações de engenharia podem ser cultivadas simultaneamente em diferentes condições mecânicas dentro de um ambiente químico controlado. 3) O biorreator permite uma camada mono de células endoteliais (CE) para ser facilmente revestidas no lado luminal dos vasos de engenharia para implantação de modelos animais. 4) Nossas biorreator também pode vasos cultura projetada com diâmetro diferentes variou de 1 mm a 3 mm, salvando o esforço para adaptar cada biorreator individuais para caber um diâmetro específico.
Os vasos engenharia cultivadas em nosso biorreator assemelham vasos sanguíneos nativa histologicamente em algum grau. Células nas paredes dos vasos expressam marcadores madura SMC contrátil, como suave cadeia muscular miosina pesada (SMMHC) 3. Uma quantidade substancial de colágeno é depositado dentro da matriz extracelular, que é responsável pela resistência mecânica final das embarcações engenharia 5. Análise bioquímica também indica que o conteúdo de colágeno dos vasos engenharia é comparável à de artérias nativas 6. Importante, o biorreator pulsátil tem constantemente regenerado vasos que apresentam propriedades mecânicas que permitem experiências de implantação bem sucedida em modelos animais 3,7. Além disso, este biorreator pode ser modificado para permitir a avaliação em tempo real e controle de remodelação do colágeno ao longo do tempo, de forma não invasiva, utilizando um microscópio óptico não-linear (NLOM) 8. Para concluir, este biorreator deve servir como uma excelente plataforma para estudar os mecanismos fundamentais que regulam a regeneração funcional de pequeno diâmetro enxertos vasculares.
Protocolo
Autoclave
Montar e autoclave a tubulação para o sistema de fluxo e componentes biorreator (biorreator si ea tampa rolha de silicone) conforme as instruções na Figura 1 e Figura 2. Alimentação por sonda tem um conector macho em uma extremidade e uma extremidade aberta do outro lado. Três segmentos de tubos curtos são inseridos através de uma tampa de silicone para a troca de gás.
1. Costura PGA Malha
- Corte PGA malha para 1,1 centímetros x ~ folha de 8 cm (dependendo do tamanho biorreator).
- Tubo de silicone Limpo (diâmetro interno de 3 mm) com água destilada (Dh20) e ar seco antes do uso. ....
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Discussão
A qualidade dos navios engenharia é em grande parte ditada pela qualidade do SMCs usado em cultura de tecidos. Os aspectos críticos do fenótipo contrátil SMC incluem morfologia, número de passagem baixa, ea capacidade de proliferar no interior do biorreator. Recomendamos que o número de passagem pode ser maior que P3, no momento da semeadura de células para o cadafalso polímero. Além disso, é crucial para confirmar que as fontes de SMC são livres de micoplasma antes do uso. Temos observado que as células contaminadas po.......
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Divulgações
Não há conflitos de interesse declarados.
Agradecimentos
Este trabalho é financiado pelo National Institutes of Health Grant R01 EB-008836 e R01 HL083895 (tanto para LEN). Poderíamos agradecer a Daryl Smith, o Glassblower University, para fazer o biorreatores para a nossa pesquisa.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Nome do reagente / Material | Fornecedor | Número Catálogo | |
| FBS (soro fetal bovino), inativado pelo calor | HyClone | SH30071 | |
| DMEM | GIBCO | 11885 | |
| rhFGF básica | R & B | 234-FSE | |
| rrPDGF-BB | R & B | 520-BB | |
| Penicilina G | Sigma | PENNA | |
| Sulfato de cobre (II) | Sigma | C8027 | |
| Gylcine | Sigma | C8790 | |
| L-alanina | Sigma | A7469-25G | |
| L-Proline | Sigma | P5607-25G | |
| Ácido ascórbico | Sigma | A4544-25G | |
| HEPES | Sigma | H3375-100G | |
| Stopper de silicone | Cole-Parmer | 06298-24 | |
| Masterflex tubos L / S | Cole-Parmer | 06508-16, 06508-18 | |
| Masterflex bomba | Cole-Parmer | 7553-80 | |
| Cuff de Dacron | Maquet | 174406 | |
| PGA sentiu | Concordia | MO000877-01 | |
| 4-0 1,5 métrica Surgipro II sutura | Syneture | VP-557-X | |
| 6-0 0,7 sutura Dexon métrica | Syneture | 7538-11 | |
| 0.22μm PTFE filtros | Whatman | 6780-2502 | |
| Três Way Parar cock- | Edwards Lifesciences | 593WSC | |
| Transdutor de pressão | Edwards Lifesciences | PX212 | |
| Sacos IV | Baxter | R4R2110 | |
| Conjunto de diluição salina | Seta | W20030 | |
| Tubo de silicone | Saint-Gobain | F05027 |
Referências
- Risau, W., Flamme, I. Vasculogenesis. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 11, 73-91 (1995).
- Fankhauser, F., Bebie, H., Kwasniewska, S. The Influcence of mechanical Forices and Flow Mechanisms on Vessel Occlusion. Lasers in Surgery and Medicine. 6, 530-532 (1987).
- Ni....
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Reimpressões e permissões
