Rotulagem de linhagem de células Zebrafish com Laser Uncagable Fluorescein Dextran

Resumo

Este protocolo delineia uma forma de rótulo e traçar o destino de pequenos grupos de células de embriões zebrafish utilizando UV-uncaging de fluoresceína enjaulado, seguido por montar todo imunomarcação para amplificar o sinal da fluoresceína uncaged.

Resumo

Um problema central na biologia do desenvolvimento é deduzir a origem da miríade de tipos de células presentes nos vertebrados que possam surgir a partir de precursores indiferenciados. Pesquisadores têm utilizado diversos métodos de rotulagem linhagem, como DII rotulagem ¹ e injeção de pressão de enzimas rastreáveis ^​​2 para verificar o destino de células em fases posteriores de desenvolvimento em sistemas-modelo. Os mapas destino primeiro peixe-zebra (Danio rerio) foram montados por meio de injeção de iontoforese de corantes fluorescentes, tais como a rodamina dextran, em células isoladas em regiões discretas do embrião e rastreamento destino da célula marcada ao longo do tempo ^3-5. Apesar de eficaz, estes métodos são tecnicamente exigentes e que requerem equipamento especializado não comumente encontrados em laboratórios de zebrafish. Recentemente, photoconvertable proteínas fluorescentes, como o Eos e Kaede, que irreversivelmente mudar de verde para vermelho quando fluorescência expostos à luz ultravioleta, estamos vendo maior utilização em zebrafish ^6-8. A claridade óptica do embrião zebrafish ea relativa facilidade de transgênese têm feito essas ferramentas particularmente atraente para a rotulagem de linhagem e de observar a migração das células in vivo ^7. Apesar de sua utilidade, essas proteínas têm algumas desvantagens em comparação com corante mediada métodos de rotulagem linhagem. Crucial a maioria é a dificuldade que temos encontrado na obtenção de resolução em 3-D de alta durante fotoconversão destas proteínas. A esta luz, talvez a melhor combinação de resolução e facilidade de uso para a rotulagem linhagem em zebrafish faz uso de gaiolas de fluoresceína dextran, um corante fluorescente que é vinculado a um grupo de têmpera que mascara seus ⁹ de fluorescência. O corante pode ser "uncaged" (lançado a partir do grupo quenching) dentro de uma célula específica usando a luz UV de uma lâmpada a laser ou mercúrio, permitindo a visualização de sua fluorescência ou imunodetecção. Ao contrário dos métodos de iontoforese, fluoresceína enjaulado pode ser injetado com aparelhos de injeção padrão e uncaged com um microscópio de epifluorescência equipado com uma pinhole ^10. Além disso, anticorpos contra fluoresceína detectar apenas a forma uncaged, eo epítopo sobrevive bem fixação ^11. Finalmente, fluoresceína enjaulado pode ser ativada com muito alta resolução 3-D, especialmente se a microscopia de dois fótons é empregada ^12,13. Este protocolo descreve um método de rotulagem linhagem de fluoresceína enjaulado e uncaging laser. Subsequenctly, uncaged fluoresceína é detectado simultaneamente com outros epitopos, como GFP pela marcação com anticorpos.

Protocolo

1. Síntese do Caged Fluorescein Dextran

1. Meça 3,5-4 mg de aminodextran e adicione dentro do tubo Invitrogen fornecidos matizado contendo 1 mg de fluoresceína CMNB gaiolas SE. Em nossas mãos esta relação dá uma carga média de ~ 2,5 moléculas de corante por dextran.
2. Adicionar 500 mL de 0,1 M ₂ B Na ₄ tampão O ₇ (borato de sódio) para o tubo.
3. Cap e vortex por 30 segundos para dissolver o aminodextran e fluoresceína enjaulado.
4. Vamos reagir durante a noite em um misturador de vórtice.
5. Retire a parte inferior de fechamento em uma coluna de spin Zeba e soltar a tampa. Marcar um ponto na coluna com uma caneta de feltro. Coloque em uma coluna de tubo de 15 mL cônico.
6. Centrifugar a 1000 xg por 2 min com o ponto de frente para o centro do rotor. Use coluna imediatamente após a compactação.
7. Colocar a coluna compactada em um tubo de 15 mL nova cônico.
8. Mistura piscina reação e transferência para o centro da cama compactado coluna de resina. Recoloque a tampa.
9. Centrifugar a 1000 xg por 2 min com o ponto de frente para o centro do rotor. Após a rodada, o eluente eo topo da coluna será mais ou menos o mesmo tom de cor amarela.
10. Transferir o eluente amarelo (~ mL 350) a um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.
11. Lyophilize à secura em um speedvac. Cobrir o speedvac com papel alumínio.
12. Re-suspender a ~ 2-3 mg resultantes de espuma amarelada na água para uma concentração final de 1% w / v.
13. Conservar a solução a -20 ° C em folhas cobertas de tubos. É uma boa idéia para a solução de dextran alíquota para evitar congelamento e descongelamento repetitivos.

2. A injeção de fluoresceína Caged Dextran em embriões Zebrafish

1. Diluir 1% de ações w / v de fluoresceína enjaulado dextran 1:05 ou 1:10 em KCl 0,2 M.
2. Injetar 0,5 - 1.0nL de solução de fluoresceína enjaulado na gema de uma célula de embriões palco usando uma pressão injector. Uma vez injetadas, embreagens de embriões devem ser mantidos no escuro a 28,5 ° C para reduzir a não-específica uncaging.
3. Remover manualmente córions a partir de embriões.
4. Anestesiar embriões em tricaina 4%.
5. Embriões serão montados em agarose 0,8% em 35mmx10mm placa de Petri, em seguida, cobertos com água de ovo.
6. Equilibrar agarose derretida em 50 bloco de aquecimento ° C por pelo menos 15 minutos.
7. Usando uma pipeta de vidro, elaborar um embrião em uma quantidade mínima de água e colocá-la no Nota agarose:. É importante para resfriar o tubo de agarose em sua mão por aproximadamente 30 segundos antes de colocar o embrião para dentro do tubo para evitar matar o embrião.
8. Pipetar o embrião do tubo, juntamente com cerca de 50μL de agarose e ejetar o conteúdo para o centro da placa de Petri.
9. Orientar rapidamente o embrião usando um fio de plástico com as células a serem uncaged voltada para cima. Nota: A agarose com frio rapidamente para ser apressada com a orientação do embrião. Embriões podem ser danificadas se manipulada após a agarose torna-se rígida.
10. Permitir que a agarose para solidificar completamente (este processo leva alguns minutos) e encher o prato dois terços cheio com água contendo ovos tricaina 4% e 0,003% PTU.

3. Laser Uncaging de fluoresceína Dextran

1. O microscópio utilizado para uncaging deve ter uma objetiva de imersão 40X água.
2. Nós usamos um Photonics Instruments laser com a célula de 365 nm corante e os 70% / 30% dividido espelho dicróico.
3. Antes de uncaging, o laser deve ser feita com o objetivo parfocal e atenuada com a potência adequada.
4. Para focar o laser, coloque uma lâmina de vidro espelhado com o objetivo e foco o objetivo até arranhões no slide são visíveis.
5. Ajustar a laser atenuador até que o laser pode produzir um risco claramente visível no espelho com um único pulso.
6. Ajuste o foco objetivo cima e para baixo. Se o laser pode produzir um risco quando o objetivo é fora de foco, ajustar o foco do laser ¼ de volta para cima ou para baixo. Repita até que o laser pode riscar apenas quando o objetivo é focada.
7. Lugar montado embrião no âmbito do objectivo e focar a área a ser uncaged.
8. Para soltar da jaula, o foco em uma célula de interesse e de pulso que 10-20 vezes menos 2-3 Hz.
9. Depois uncaging, embrião do livre por raspagem agarose afastado com uma pinça e colocá-los em água contendo ovos PTU 0,003%. Deixe os embriões se desenvolvem em uma caixa à prova de luz até que sejam corrigidos.

4. Rotulagem de anticorpos e Detecção de Fluoresceína Uncaged Dextran

1. Fix embriões em Ab fixadora (paraformaldeído 4%, 0,3 CaCl _2, 8% de sacarose, fosfato de 1X tampão pH, solução salina 7,3) por 2-4 horas à temperatura ambiente (RT) ou durante a noite (O / N) a 4 ° C. Manter os embriões em uma caixa de luz apertado ou embrulhado em papel alumínio do tubo para todas as etapas rotulagem.
2. Remover fixador e substituir com MeOH 100%, deixe por 10 minutos a RT, remova e substitua MeOHce com MeOH 100% fresco.
3. Loja em MeOH a -20 ° C durante pelo menos 30 minutos. Nota: Você pode armazenar em MeOH por até duas semanas antes de começar a degradar epitopos.
4. Reidratar embriões com 5 lavagens minuto a RT de 75% de fosfato MeOH/1X solução salina tamponada com 0,1% Tween 20 (1X PBSTw), então 1XPBTw 50% MeOH/50%, então 25% MeOH/75% 1X PBSTw.
5. Lavar três vezes por 5 minutos em 1XPBSTw.
6. Se os embriões são> 24 horas de idade, permiabilize embriões com 10 mcg / mL proteinase K em 1XPBSTw. Permiabilization tempo é dependente no palco. Cinco minutos em proteinase K é suficiente se os embriões são entre 24 e 48 horas pós-fertilização (hpf). Mais tempo pode ser necessária se para mais larvas. Re-fix em Ab fixadora por 20 minutos a RT
7. Lavar cinco vezes por 5 minutos em 1XPBSTw na RT.
8. Incubar em solução de bloco (1XPBS, Triton x100 0,1%, 10% de soro de ovelha, 10% de soro bovino albumina, 1% Dimetil sulfóxido) por 1-2 horas em temperatura ambiente.
9. Diluir anticorpos primários (anti-fluoresceína mais anticorpos contra células do tipo marcadores específicos) em solução de bloqueio.
10. Embriões incubar S / N, 4 ° C em solução contendo anticorpos primários.
11. Lavar quatro vezes por 20 minutos em 1XPhosphate Buffered Saline com Triton x100 0,1% (PBSTx) em temperatura ambiente.
12. Diluir fluorescente marcado com anticorpos secundários (geralmente 1:300) em solução de bloqueio.
13. Incubar S / N, 4 ° C em solução contendo anticorpos secundários.
14. Lavar quatro vezes por 20 minutos em 1XPBSTx na RT.
15. Embriões claro em 50% 1XPBS glycerol/50% para pelo menos duas horas em temperatura ambiente, em seguida, remover o glicerol / PBS mistura e adicione glicerol 100% e deixe descansar O / N a 4 ° C.

5. Resultados representativos:

Depois de imunomarcação, deve haver uma área enriquecida de coloração nas células que foram uncaged (Figura.1). Não é incomum ver um sinal relativamente alta-ruído em> zebrafish 48 horas de idade, devido a uncaging espontânea da fluoresceína.

Figura 1. Lineage rotulagem de zebrafish complexo pineal. Aos 24 hpf, uma parte do primórdio anterior pineal, indicado por foxd3:. Expressão GFP, foi uncaged utilizando pulsos de laser UV A) Ao 48hpf, um cluster do lado esquerdo de células chamado de parapineal (círculo vermelho) surgiu a partir da uncaged domínio (círculo branco). B) sinal de fluoresceína Uncaged é enriquecido no círculo (parapineal vermelho) e do órgão pineal (círculo branco).

Discussão

Como descrito, este protocolo fornece um método de rotulagem relativamente rápido linhagem em zebrafish que é construída sobre as técnicas comumente usadas de microinjeção, microscopia e de imunofluorescência. Nós descobrimos que o laser uncaging ser a forma mais eficiente e de custo eficaz para libertar da gaiola de fluoresceína de uma forma localizada. Este método poderia ser usado para rotular linhagem com pontos de extremidade experimental tão tarde como 4 dpf. No entanto, como as células se dividem, a concentração ...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
CMNB-caged fluorescein SE	Invitrogen	C20050
Aminodextrana, 10 kDa	Invitrogen	D1860
Colunas de centrifugação para dessalinização Zeba	Pierce, Thermo Scientific	89889
anticorpo de cabra anti-fluoresceína	Invitrogen	A11095
anticorpo Alexa Fluor 633 de jumento anti-cabra	Invitrogen	A21082
placas de Petri 35 mm x 10 mm	BD Biosciences	351008
microscópio composto ereto com objetiva de imersão em água 40x	Leica Microsystems	DM6000B
Sistema manual de iluminação a laser MicroPoint	Photonic Instruments
Feniltioureia (PTU)	Alfa Aesar	L06690
Tricaina	Sigma-Aldrich	E10521
Protease K	Roche Group	03115836991
filamento plástico	Qualquer fornecedor
Agarose	Research Products International Corp.	A20090
SpeedVac	Thermo Fisher Scientific, Inc.	Savant SPD131DDA
misturador vortex	VWR international	Vortex Genie 2
injetor de pressão	Applied Scientific Instrumentation	MPPI-3