Este protocolo delineia uma forma de rótulo e traçar o destino de pequenos grupos de células de embriões zebrafish utilizando UV-uncaging de fluoresceína enjaulado, seguido por montar todo imunomarcação para amplificar o sinal da fluoresceína uncaged.
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Artigo de método
Rotulagem de linhagem de células Zebrafish com Laser Uncagable Fluorescein Dextran
Neste artigo
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Resumo
Resumo
Um problema central na biologia do desenvolvimento é deduzir a origem da miríade de tipos de células presentes nos vertebrados que possam surgir a partir de precursores indiferenciados. Pesquisadores têm utilizado diversos métodos de rotulagem linhagem, como DII rotulagem 1 e injeção de pressão de enzimas rastreáveis 2 para verificar o destino de células em fases posteriores de desenvolvimento em sistemas-modelo. Os mapas destino primeiro peixe-zebra (Danio rerio) foram montados por meio de injeção de iontoforese de corantes fluorescentes, tais como a rodamina dextran, em células isoladas em regiões discretas do embrião e rastreamento destino da célula marcada ao longo do tempo 3-5. Apesar de eficaz, estes métodos são tecnicamente exigentes e que requerem equipamento especializado não comumente encontrados em laboratórios de zebrafish. Recentemente, photoconvertable proteínas fluorescentes, como o Eos e Kaede, que irreversivelmente mudar de verde para vermelho quando fluorescência expostos à luz ultravioleta, estamos vendo maior utilização em zebrafish 6-8. A claridade óptica do embrião zebrafish ea relativa facilidade de transgênese têm feito essas ferramentas particularmente atraente para a rotulagem de linhagem e de observar a migração das células in vivo 7. Apesar de sua utilidade, essas proteínas têm algumas desvantagens em comparação com corante mediada métodos de rotulagem linhagem. Crucial a maioria é a dificuldade que temos encontrado na obtenção de resolução em 3-D de alta durante fotoconversão destas proteínas. A esta luz, talvez a melhor combinação de resolução e facilidade de uso para a rotulagem linhagem em zebrafish faz uso de gaiolas de fluoresceína dextran, um corante fluorescente que é vinculado a um grupo de têmpera que mascara seus 9 de fluorescência. O corante pode ser "uncaged" (lançado a partir do grupo quenching) dentro de uma célula específica usando a luz UV de uma lâmpada a laser ou mercúrio, permitindo a visualização de sua fluorescência ou imunodetecção. Ao contrário dos métodos de iontoforese, fluoresceína enjaulado pode ser injetado com aparelhos de injeção padrão e uncaged com um microscópio de epifluorescência equipado com uma pinhole 10. Além disso, anticorpos contra fluoresceína detectar apenas a forma uncaged, eo epítopo sobrevive bem fixação 11. Finalmente, fluoresceína enjaulado pode ser ativada com muito alta resolução 3-D, especialmente se a microscopia de dois fótons é empregada 12,13. Este protocolo descreve um método de rotulagem linhagem de fluoresceína enjaulado e uncaging laser. Subsequenctly, uncaged fluoresceína é detectado simultaneamente com outros epitopos, como GFP pela marcação com anticorpos.
Protocolo
1. Síntese do Caged Fluorescein Dextran
- Meça 3,5-4 mg de aminodextran e adicione dentro do tubo Invitrogen fornecidos matizado contendo 1 mg de fluoresceína CMNB gaiolas SE. Em nossas mãos esta relação dá uma carga média de ~ 2,5 moléculas de corante por dextran.
- Adicionar 500 mL de 0,1 M 2 B Na 4 tampão O 7 (borato de sódio) para o tubo.
- Cap e vortex por 30 segundos para dissolver o aminodextran e fluoresceína enjaulado.
- Vamos reagir durante a noite em um misturador de vórtice.
- Retire a parte inferior de fechamento em uma coluna de spin Zeba e soltar a tampa. Marcar um ponto na colun....
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Discussão
Como descrito, este protocolo fornece um método de rotulagem relativamente rápido linhagem em zebrafish que é construída sobre as técnicas comumente usadas de microinjeção, microscopia e de imunofluorescência. Nós descobrimos que o laser uncaging ser a forma mais eficiente e de custo eficaz para libertar da gaiola de fluoresceína de uma forma localizada. Este método poderia ser usado para rotular linhagem com pontos de extremidade experimental tão tarde como 4 dpf. No entanto, como as células se dividem, a concentração .......
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Divulgações
Não há conflitos de interesse declarados.
Agradecimentos
Gostaríamos de agradecer a Dan Carlin para ajudar na tomada de fluoresceína enjaulado. Além disso, gostaríamos de agradecer as fontes de financiamento seguintes: Vanderbilt University Medical School Programa de Grant Developmental Biology Formação de JAC, e NIH HD054534to JTG.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| CMNB-caged fluorescein SE | Invitrogen | C20050 | |
| Aminodextrana, 10 kDa | Invitrogen | D1860 | |
| Colunas de centrifugação para dessalinização Zeba | Pierce, Thermo Scientific | 89889 | |
| anticorpo de cabra anti-fluoresceína | Invitrogen | A11095 | |
| anticorpo Alexa Fluor 633 de jumento anti-cabra | Invitrogen | A21082 | |
| placas de Petri 35 mm x 10 mm | BD Biosciences | 351008 | |
| microscópio composto ereto com objetiva de imersão em água 40x | Leica Microsystems | DM6000B | |
| Sistema manual de iluminação a laser MicroPoint | Photonic Instruments | ||
| Feniltioureia (PTU) | Alfa Aesar | L06690 | |
| Tricaina | Sigma-Aldrich | E10521 | |
| Protease K | Roche Group | 03115836991 | |
| filamento plástico | Qualquer fornecedor | ||
| Agarose | Research Products International Corp. | A20090 | |
| SpeedVac | Thermo Fisher Scientific, Inc. | Savant SPD131DDA | |
| misturador vortex | VWR international | Vortex Genie 2 | |
| injetor de pressão | Applied Scientific Instrumentation | MPPI-3 |
Referências
- Hatada, Y., Stern, C. D. A fate map of the epiblast of the early chick embryo. Development. 120, 2879-2889 (1994).
- Moody, S. A. Fates of the blastomeres of the 32-cell-stage Xenopus embryo. Dev Biol. 122, 300-319 (1987).
- Wetts, R., Fraser, S. E.
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Reimpressões e permissões
Errata
Formal Correction: Erratum: Lineage Labeling of Zebrafish Cells with Laser Uncagable Fluorescein Dextran
Posted by JoVE Editors on 5/25/2011. Citeable Link.
A correction was made to Lineage Labeling of Zebrafish Cells with Laser Uncagable Fluorescein Dextran. There was an error in the authors, Ilya A. Shestopalov and James K. Chen, names. The author's names have been corrected to:
Ilya A. Shestopalov and James K. Chen
instead of:
Ilya Shestopalov and James Chen
