Sete Passos para Stellate Células

Resumo

Aqui nós descrevemos um método para o isolamento de células estreladas hepáticas do fígado do rato. Para a purificação de células estreladas, fígado de camundongos são digeridos In situ E In vitro Por pronase colagenase-tratamento antes da centrifugação em gradiente de densidade. Esta técnica produz células estreladas hepáticas de alta pureza.

Resumo

Células estreladas hepáticas são fígado residente células de estrelas, como morfologia e estão localizados no espaço de Disse entre fígado sinusoidal células endoteliais e hepatócitos ^1,2. Células estreladas são derivados de precursores da medula óssea e armazenar até 80% do total do corpo de vitamina A ^{1, 2.} Após a ativação, as células estreladas diferenciar em miofibroblastos para produzir matriz extracelular, contribuindo para a fibrose hepática ^3. Base na sua capacidade de contratar, as células estreladas miofibroblástica pode regular o tom vascular associada à hipertensão portal ^4. Recentemente, nós demonstramos que as células estreladas hepáticas são células antígeno apresentando potentes e podem ativar as células NKT, bem como convencionais linfócitos T ^5.

Aqui apresentamos um método eficiente para a preparação de células estreladas hepáticas do fígado do rato. Devido à sua localização perisinusoidal, o isolamento de células estreladas hepáticas é um processo multi-passo. A fim de tornar as células estreladas acessíveis ao isolamento do espaço de Disse, fígado de camundongos são perfundidos in situ com a enzimas digestivas pronase E e perfusão colagenase P. Em seguida, o tecido hepático é submetido a tratamento enzimático adicionais com pronase E e P colagenase em vitro. Posteriormente, o método tira proveito da enorme quantidade de gotículas de vitamina A de armazenamento de gordura nas células estreladas hepáticas. Este recurso permite a separação de células estreladas de outros tipos de células hepáticas por centrifugação em um gradiente Nycodenz 8%. O protocolo aqui descrito produz uma população altamente pura e homogénea de células estreladas. Pureza das preparações podem ser avaliados através da coloração para a molécula de proteína glial fibrilar ácida marcador (GFAP), antes da análise por microscopia de fluorescência ou citometria de fluxo. Além disso, microscopia de luz revela a aparência única em forma de estrela de células hepáticas estreladas que abrigam grandes quantidades de gotículas lipídicas.

Tomados em conjunto, nós apresentamos um protocolo detalhado para o isolamento eficiente de células estreladas hepáticas, incluindo imagens representativas de sua aparência morfológica e expressão GFAP que ajudam a definir a entidade de células estreladas.

Protocolo

Camundongos C57BL / 6 deve ser usado em ~ 20 semanas de idade ou mais. O uso de camundongos machos pesando 25-30g é recomendado. O rendimento das células estreladas pode ser aumentado pela alimentação camundongos uma vitamina Uma dieta enriquecida por 2 meses antes do isolamento de células estreladas. Cerca de 2x10 ⁵ células estreladas hepáticas pode ser purificado a partir do fígado de um camundongo C57BL / 6, enquanto o rendimento de células estreladas de camundongos Balb / c é consideravelmente maior. O protocolo que se segue é ajustada para 5 camundongos. Cuidados com os animais e experimentação foram realizados em conformidade com o Animal Care aprovado Institucional e protocolos Comitê Use.

1. Na perfusão in situ de fígado de camundongos com enzimas digestivas

1. Aquecer o tampão SC1 e soluções para perfusão enzima em banho-maria a 37 ° C.
2. Montar um set de infusão com asas no tubo de silicone de uma bomba peristáltica.
3. Calibrar a bomba com PBS para obter um fluxo laminar de 6.5ml/min, que é a vazão que serão utilizados para a situ na perfusão do fígado. Equilibrar o tubo de silicone com SC1 solução.
4. Anestesiar o rato por injeção intraperitoneal de ketamina (90 mg / kg) e xilazina (10 mg / kg) e solução de teste de perda de reflexos para garantir narcotização profundo.
5. Corrigir o mouse na posição supina em uma superfície apropriada.
6. Use uma tesoura e uma pinça para realizar uma incisão longitudinal na pele abdominal e expor o peritônio.
7. Abra cuidadosamente o peritônio e mover os intestinos para fora da cavidade abdominal para o lado esquerdo do animal a fim de expor a veia portal.
8. Inserir a cânula do conjunto de perfusão na veia portal. Para esta etapa, o uso de um microscópio estereoscópico é recomendado.
9. Iniciar a perfusão do fígado com solução SC1 30ml. Abra a veia cava inferior imediatamente após o início do fluxo. Rubor bem sucedida do fígado é indicada por uma perda de cor do tecido do fígado.
10. Perfundir o fígado com a solução de 30ml pronase E. Após a digestão bem-sucedido, os lobos do fígado vai inchar, e os lóbulos aparecerá distintas através da cápsula.
11. Perfundir o fígado com a solução de colagenase P 30ml. O fígado neste momento perdeu sua forma e aparência atônica e amorfo.
12. Separe cuidadosamente o fígado a partir do diafragma e órgãos circundantes e armazená-lo em 70ml de solução SC2 no gelo.
13. Repita o procedimento para ratos adicionais.

2. Digestão in vitro de fígado de camundongos

Todas as outras etapas de trabalho deve ser realizado sob condições estéreis em capela de fluxo laminar.

1. Corte o fígado em pedaços de aproximadamente 2x2x2mm ³ usando uma tesoura afiada.
2. Combine a suspensão de 70ml SC2 incluindo os pedaços de fígado com 50ml de solução pronase P E-colagenase e adicionar 1 ml de solução de DNase I.
3. Digerir os fígados por 20min a 37 ° C, agitando.

3. Centrifugação em gradiente de densidade

1. Filtrar a suspensão de células através de filtros de células 70μm em 6 tubos de 50ml Falcon e adicionar até 50ml com SC2 buffer. Centrifugar por 10 minutos em 600g e 4 ° C.
2. Aspirar cuidadosamente 40ml do sobrenadante, em seguida, adicione 150μl DNase solução que eu a cada tubo e ressuspender as células.
3. Piscina das suspensões de células em 4 tubos de 50ml Falcon e lave com GBSS-B, centrifugar por 10 minutos em 600g e 4 ° C.
4. Aspirar cuidadosamente o máximo de sobrenadante quanto possível, sem perturbar o sedimento e adicionar 150μl DNase solução que eu a cada tubo. Ressuspender o pellets de células em 10ml GBSS-B por tubo.
5. Piscina as células em dois tubos de 50ml Falcon e adicione GBSS-B para um volume total de 36ml por tubo. Adicionar 14ml de solução Nycodenz a cada tubo e misture bem.
6. Transferência de 10ml da suspensão de células em um tubo de centrifugação 12ml gradiente, resultando em 10 tubos no total. Delicadamente sobrepor a suspensão de células com 1,5 ml GBSS-B por tubo.
7. Centrifugar os gradientes de 15 min a 1500g e 4 ° C, sem freio. Posteriormente, hepatócitos será peletizada na parte inferior do tubo enquanto que as células estreladas são encontrados na interfase como um anel branco.
8. Cuidadosamente a colheita interfase contendo as células estreladas e lavá-los com GBSS-B; centrifugar por 10 minutos em 600g e 4 ° C.
9. Aspirar o sobrenadante e ressuspender as células em DMEM suplementado com 20ml inativado pelo calor de 10% FBS, HEPES 1% Penicilina / Estreptomicina, 2mM L-Glutamina, piruvato de sódio 1 mM e 10 mM. Transferência das células em frascos de cultura de tecidos com uma concentração de 2x10 ⁴ células / cm ^2. Incubar as células a 37 ° C e 5% CO _2.
10. Troque a mídia assim que as células estreladas hepáticas são aderentes (cerca de 2h após a preparação) para lavar as células mortas e restos celulares.
11. No dia seguinte, a célula estreladass deve desenvolver sua morfologia em forma de estrela com característica perinuclear vesículas vitamina A-armazenar lipídios.
12. Para os experimentos subseqüentes, as células estreladas hepáticas pode ser facilmente destacado das superfícies não-revestido de plástico leve usando soluções enzimáticas, tais como Accutase, por exemplo,

4. Resultados representativos:

Após a preparação de células estreladas hepáticas utilizando o protocolo fornecido, a pureza da população isolada podem ser testadas considerando três principais características deste tipo de célula, como estrelas, como a forma, gotículas lipídicas perinuclear, e expressão da proteína glial fibrilar ácida (GFAP ). Imagens representativas para o aspecto característico de células estreladas hepáticas 2h após o isolamento de células, bem como no dia 1 e 3 de cultura in vitro são apresentadas na Figura 1. A Figura 2 mostra uma coloração representante de imunofluorescência para GFAP em células estreladas hepáticas, que foram cultivadas por 3 dias após o isolamento de células. Células estreladas hepáticas diferenciar em células miofibroblástica durante a cultura in vitro. A marca característica dessas células estreladas ativadas é a expressão de alfa actina de músculo liso (αSMA). A Figura 3 mostra a coloração de imunofluorescência para ASMA e IIA miosina em células estreladas ativadas no dia 7 de cultura in vitro.

Figura 1. Morfologia característica de células estreladas hepáticas. Células estreladas foram isoladas de fígado de camundongos usando o protocolo fornecido. As imagens retratam 2h células estreladas após o isolamento da célula (a, b), bem como no dia 1 (c) e dia 3 (d) de cultivo in vitro. Células estreladas hepáticas apresentam grandes quantidades de vesículas lipídicas em locais perinuclear e adquirir sua morfologia astral distintivo como durante os primeiros dias de cultivo in vitro (Ampliação de 200x).

Figura 2. Células estreladas hepáticas especificamente expressar GFAP no fígado. Células estreladas foram isoladas e coradas para immunofluorescently GFAP (vermelho) no dia 3 de cultura in vitro. Núcleos das células são representadas em azul (Hoechst mancha).

Figura 3. Células estreladas hepáticas diferenciar em miofibroblastos. Células estreladas hepáticas isoladas de camundongos C57BL / 6 foram cultivadas por 7 dias. Posteriormente, eles foram transferidos para câmara de slides e corados para ASMA (mostrada em vermelho) e IIA miosina (representado em verde). Os núcleos das células foram contracorados com Hoechst (azul).

SC1 buffer
EGTA	190mg
Glicose	900mg
HEPES	10 ml de solução 1M de ações
KCl	400mg
Na 2 HPO 4 x 2 H 2 O	151mg
NaCl	8g
NaH 2 PO 4 x H 2 O	78mg
NaHCO 3	350mg
Vermelho de fenol	6mg
dH 2 O	preencher até 1l
SC2 buffer
CaCl 2 x 2H 2 O	560mg
HEPES	10ml de solução estoque 1M
KCl	400mg
Na 2 HPO 4 x 2 H 2 O	151mg
NaCl	8g
NaH 2 PO 4 x H 2 O	78mg
NaHCO 3	350mg
Vermelho de fenol	6mg
dH 2 O	preencher até 1l
GBSS-A Tampão
KCl	370mg
CaCl 2 x 2H 2 O	225mg
Glicose	991mg
KH 2 PO 4	30mg
MgCl 2 x 6 H 2 O	210mg
MgSO 4 x 7 H 2 O	70mg
Na 2 HPO 4 x 2 H 2 O	75mg
NaHCO 3	227mg
Vermelho de fenol	6mg
dH 2 O	preencher até 1l
GBSS-B buffer
CaCl 2 x 2H 2 O	225mg
Glicose	991mg
KCl	370mg
KH 2 PO 4	30mg
MgCl 2 x 6 H 2 O	210mg
MgSO 4 x 7 H 2 O	70mg
Na 2 HPO 4 x 2 H 2 O	75mg
NaCl	8g
NaHCO 3	227mg
Vermelho de fenol	6mg
dH 2 O	preencher até 1l
Pronase solução de perfusão E
E pronase	100mg (4000 PU / mg min)
SC2 buffer	200ml
Colagenase solução de perfusão P
Colagenase P	85mg (1,78 U / mg lyo)
SC2 buffer	200ml
Pronase E-colagenase Solução P
E pronase	50mg (4000 PU / mg min)
Colagenase P	85mg (1,78 U / mg lyo)
SC2 buffer	50ml
Solução DNase I
DNase I	6mg (ca. 2000U/mg)
GBSS-B	3ml
Nycodenz Solution
Nycodenz	8g
GBSS-A	28ml

Tabela 1. Buffers e soluções de enzima necessária para o isolamento de células estreladas hepáticas. O pH de todos os buffers deve ser ajustado para 7,3-7,4. Além disso, a filtração estéril de todos os buffers é recomendado. É importante adaptar a quantidade de enzima utilizada de acordo com a determinada atividade enzimática.

Discussão

Células estreladas hepáticas regular essenciais processos fisiológicos e fisiopatológicos no fígado. Além disso, as células estreladas possuem propriedades apresentadoras de antígenos, tornando-os um importante componente da resposta imune hepática. Embora as células estreladas hepáticas compreendem 10-15% do número total de células no fígado, o isolamento dessas células é um desafio devido à sua localização no espaço de Disse perisinusoidal.

Aqui apresentamos um método simples para isolar a...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Nome do reagente	Companhia	Catalog No.
70μm Filtro celular	BD	352350
CaCl 2 x 2H 2 O	Sigma-Aldrich	C3306
Colagenase P	Roche	11249002001
DMEM	Gibco	11960
DNase I	Roche	10104159001
DPBS	Cellgro	21-031 cv-
EGTA	Fluka	3777
Soro fetal bovino	Gibco	16000
Glicose	Sigma-Aldrich	G7528
Tubos de centrifugação de gradiente	Greiner Bio-One	163160
HEPES	Gibco	15630
KCL	Sigma-Aldrich	P9541
KH 2 PO 4	Sigma-Aldrich	P9791
L-Glutamina	Gibco	25030
MgCl 2 x 6H 2 O	Fluka	63068
MgSO 4 x 7H 2 O	Sigma-Aldrich	M2773
Na 2 HPO 4 x 2H 2 O	Fluka	71643
NaCl	Sigma-Aldrich	S3014
NaH 2 PO 4 x H 2 O	Fluka	71507
NaHCO 3	Fluka	71628
Nycodenz	Accudenz AG	AN7050/BLK
Penicilina / estreptomicina	Gibco	15140
Bomba peristáltica	Cole Parmer	HV-7523-70
Vermelho de fenol	Sigma-Aldrich	P4633
E pronase	Calbiochem	7433-2
Tubo de silicone	Masterflex	HV-96440-14
Piruvato de sódio	Gibco	11360
Frasco de cultura de tecidos (25 cm 2)	BD	353108
Set de infusão com asas	Terumo	1SV27EL