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$$\longrightharp{xx}$$,
1. Considerações sobre a clonagem
- Oligonucleotides comercialmente preparado representando o TMD de interesse ladeado por NheI e sítios de restrição BamHI e 5'-fosforilada pode ser ligada em pTox7 (modificado em nosso laboratório pela inserção de um par de base logo após a restrição BamHI 14 sites) (Figura 3) digerida seqüencialmente com BamHI e NheI. Um oligonucleotídeo exemplo é mostrado abaixo:
5'ctagcTMDSEQUENCEg3 '
3 'gTMDSEQUENCEcctag5'
A seqüência deve ser DTM 24/12 resíduos (seqüências mais curtas será presumivelmente alongada por resíduos hidrofóbicos vetor codificado). , A fim de investigar a interface, quatro variantes do projeto DTM devem ser criados onde inserções resíduo seqüencial e concomitante resíduo resultado eliminações em rotação da DTM em relação ao ToxR 15,16. Finalmente, a concentração deve ser arabinose variou entre 0,001 e 0,01% (w / v) para identificar a concentração onde as diferenças máximo em β-galactosidase sinais entre diferentes seqüências de DTM são observados; testar diferentes níveis de expressão é recomendado para identificar as condições sob as quais afinidades diferentes podem ser distinguidos melhor. Além de arabinose e antibióticos, 0,4 mM IPTG pode ser usado para melhorar as diferenças de afinidades entre DTM diferentes. A medição ToxR deve ser realizada pelo menos em quatro vias. Todo o procedimento deve ser repetido pelo menos três vezes com diferentes transformações plasmídeo.
2. Crescimento de culturas bacterianas
- Suavemente descongelar FHK12 células competentes (200 mL) no gelo e transferir para um tubo de cultura de 15 ml. Adicionar DNA plasmídeo (200 ng) e incubar as células no gelo por 30 min.
- Choque térmico células de incubação por 90 s em 42 ° C, seguido de incubação em gelo por 2 min.
- Adicionar SOC media (800 mL) e incubar as amostras a 37 ° C com agitação (300 rpm) para um h.
- Inocular 5 ml de mídia LB com cloranfenicol (30 mcg / ml) e arabinose (0,0025% w / v), com 50 ul da mistura transformação em tubos de 15 ml de cultura em triplicado. Incubar as amostras a 37 ° C com agitação (300 rpm) por 20 h. (Alternativamente 5 mL da cultura pode ser usada para inocular 100 ml de meio em uma placa de 96 poços. Este método é útil quando se lida com um grande número de amostras, apesar de erros vai ser um pouco maior. Para evitar a evaporação, o que levaria ao erro, preencha os poços ultraperiféricas com a mídia, mas não usá-los para as amostras. Finalmente, dê um duplo-wrap a articulação entre a tampa ea placa com parafilme).
3. Medição de β-galactosidase Atividade
- Pré-aqueça o leitor de placas a 28 ° C.
- Transferir o Z-buffer em um reservatório com uma ponteira de grande porte, certificando-se de levar apenas a camada (aquoso) superior. Transferência de 100 l de Z-buffer/chloroform preparada para os poços de uma placa de 96 poços. Transferir 5 mL de cada cultura para os poços da placa em quatro vias. Omitir a cultura a partir de quatro poços, que servirá como o branco.
- Medir o OD 595 da placa para determinar a densidade de células.
- Adicionar 50 ul de Z-buffer/SDS a todos os poços da placa. Agite a placa na placa-leitor por 10 min para Lyze as células. Certifique-se que as suspensões de células são claras depois da lise e repita o passo tremendo, se necessário. Lise incompleta sugere a Z-buffer/chloroform não estava preparada.
- Adicionar 50 ul preparada Z-buffer/ONPG a todos os poços e voltar a placa para o leitor de placas e medir OD 405 a cada 30 s por 20 min.
- Calcular β-galactosidase atividade usando a seguinte equação (lembrando-se de subtrair o branco). A proporção de OD 405 / min deve ser calculado usando todos os pontos de dados na faixa de 405 OD 0,0-1,0 usando um ajuste do modelo linear.
Miller unidades diferentes, por vezes, quando gravadas em dias diferentes. Portanto, uma construção de referência como o GPA deveria ser medido em cada ensaio. Seus valores podem ser utilizados para a normalização dos valores ToxR.
4. Controle para a expressão da proteína
- Executar Western blotting para verificar mesmo a expressão da proteína entre os construtos. Combine 50 ul das culturas triplicado e centrifugar (2000 rpm, 4 min) em microcentrífuga. Retire o sobrenadante por pipetagem e ressuspender o sedimento residual em 2 x de tampão de carregamento de amostra.
- Load 7,5 mL em um gel padrão de 8% e realização de eletroforese a 125 V durante 1 min horas 5. Após a transferência, incube com anticorpos anti-MBP HRP-conjugado e visualizar, a proteína quimérica é observado em aproximadamente 70 kDa com alguns produtos de degradação, por vezes visto em torno de 48 kDa. MBP endógena também é observado em 45 kDa (Figura 5).
5. Controle de Inserção Membrana adequada
A linhagem de células deficientes em proteína de ligação a maltose é utilizado para avaliar a inserção adequada da membrana da construção TMD quimérico. Quando cultivada em meio mínimo com maltose como a única fonte de carbono, apenas células que expressam uma membrana-integrante do produto expressão com maltose binding protein corretamente localizado à periplasma são capazes de crescer.
- PD28 transformar células (como descrito para FHK12 células) e inocular 2 ml de meio LB. Cultivar as células a 37 ° C com agitação (300 rpm) durante a noite.
- Agregar as células por centrifugação a 3500 rpm, 10 min, 4 ° C e lavar por ressuspensão em PBS (2 ml) por pipetagem gentil com uma ponta grande ou vórtex gentil. Agregar as células (como acima), lavar com PBS por uma segunda vez, pelota e, finalmente, ressuspender em PBS (1 ml).
- Use 25 mL de células em suspensão para inocular 5 ml meio mínimo em triplicado e incubar a 37 ° C com agitação (300 rpm). Tome OD 595 leituras entre 15-25 h, aproximadamente a cada duas horas, transferindo 200 mL de cada amostra em uma placa de 96 poços e leitura usando a placa-reader.
6. Resultados representativos:
Um exemplo do uso do ensaio repórter ToxR transcricional para analisar a propensão oligomerização de domínios transmembrana mostrado na Figura 4. Anteriormente nós investigamos a oligomerização de domínios transmembrana da membrana multispanning-integrante da membrana latente proteína-proteína 1 (LMP-1) por várias técnicas, incluindo ToxR 14 domínios transmembrana cinco (TM5) foi mostrado para exibir uma forte propensão a oligomerize.; Isso é demonstrado pelo alto Unidades Miller, comparável ao controle positivo, o GPA, uma seqüência bem estabelecida dimerizing. Uma mutação deletéria no TM5, D150A, reduz a capacidade da seqüência a oligomerize. LMP-1 TM1 não significativamente oligomerize e exibe um sinal de unidade muito baixo Miller, um pouco acima do sinal para branco, não transformados FHK12 células.
Figura 1 dos desenhos animados. Retratando o ensaio repórter ToxR. Domínio transmembrana (DTM) impulsionado resultados oligomerização na dimerização de ToxR e ativação da transcrição LacZ. O produto do gene de LacZ, β-galactosidase pode ser quantificada como uma medida da propensão de um TMD de oligomerize.
Figura 2. A clivagem hidrolítica de ONPG pela β-galactosidase resulta na produção da espécie luz absorvendo o nitrophenolate (ONP).
Figura 3. Mapa Plasmid de pToxR7.
Figura 4. Representante ToxR ensaio repórter transcricional analisar a propensão oligomerização de membrana latente proteína-1 domínios transmembrana. Domínio transmembrana 5 (TM5) oligomerizes fortemente, enquanto um domínio transmembrana (TM1) exibe apenas uma interação fraca. D150A mutação no TM5 reduz significativamente sua capacidade de oligomerize. GPA é incluída como uma seqüência de controle positivo para a dimerização forte. Em branco representa untransformed FHK12 células.
Figura 5. Western blot para expressão da proteína.
Figura 6. PD28 ensaio de complementação para controlar a inserção da membrana correto para o periplasma. Controle negativo representa uma construção deficiente em proteína de ligação maltose.