Transmembrana Propensão Oligomerização Domínio determinado pelo Assay ToxR

Resumo

Um procedimento eficiente para avaliar a propensão oligomerização de domínios de uma única passagem transmembrana (DTM) é descrito. Proteínas quiméricas que consiste na DTM fundido a ToxR são expressos em uma cepa de E. coli repórter. DTM induzida por oligomerização causas dimerização de ToxR, a ativação de transcrição e de produção da proteína repórter, galactosidase.

Resumo

A visão simplista de domínios transmembrana da proteína como meramente âncoras em bicamadas de fosfolipídios foi há muito refutada. Em muitos casos, membrana que mede as proteínas têm evoluído mecanismos altamente sofisticados de ação. Uma maneira ^03/01 em que as proteínas da membrana são capazes de modular as suas estruturas e funções é por contato direto e específico de hélices hidrofóbicas, formando oligômeros transmembrana estruturado ^4,5. Recentes Grande trabalho centrou-se na distribuição de aminoácidos preferencialmente encontrados no ambiente de membrana, em comparação com solução aquosa e as diferentes forças intermoleculares que a associação de unidade de proteína. ^6,7 No entanto, os estudos de reconhecimento molecular no domínio transmembrana das proteínas ainda fica atrás dos solúvel em água regiões. Um grande obstáculo continua: apesar da especificidade e afinidade notável que oligomerização transmembrana pode atingir de ⁸ a medição direta de sua associação é um desafio. Metodologias tradicionais aplicadas ao estudo da função integrante da membrana da proteína pode ser dificultada pela insolubilidade inerente das sequências em análise. Percepções biofísicos adquirida com a estudar peptídeos sintéticos representando domínios transmembrana pode fornecer informações estruturais úteis. No entanto, a relevância biológica da micelar detergente ou sistemas de lipossomas utilizados nestes estudos para imitar membranas celulares é muitas vezes questionada; fazer peptídeos adotar uma estrutura semelhante à nativa nessas condições e não o seu comportamento funcional refletem verdadeiramente o modo de ação dentro de uma membrana nativa ? A fim de estudar as interações de seqüências transmembrana em bicamadas de fosfolipídeos naturais, o laboratório de ensaios desenvolvidos Langosch repórter ToxR transcricional. ⁹ domínios transmembrana O de interesse é expressa como uma proteína quimérica, com ligação às proteínas maltose de localização para o periplasma e ToxR a apresentar um relatório do nível de oligomerização (Figura 1).

Na última década, vários outros grupos (por exemplo, Engelman, DeGrado, Shai) otimizados e aplicados neste ensaio repórter ToxR. ^10-13 Os ensaios ToxR vários tornaram-se um padrão-ouro para testar interações proteína-proteína em membranas celulares. Nós aqui demonstrar uma operação típica experimental realizado em nosso laboratório que segue protocolos desenvolvidos principalmente por Langosch. Este método de aplicação geral é útil para a análise de transmembrana associação auto-domínio em E. coli, onde β-galactosidase de produção é utilizado para avaliar a propensão oligomerização DTM. Após a DTM induzida por dimerização, ToxR se liga ao promotor ctx causando aumento da regulação do gene LacZ para β-galactosidase. A leitura colorimétrica é obtida pela adição de ONPG às células lisados. Clivagem hidrolítica de ONPG pela β-galactosidase resulta na produção da espécie luz absorvendo o nitrophenolate (ORA) (Figura 2).

Protocolo

1. Considerações sobre a clonagem

1. Oligonucleotides comercialmente preparado representando o TMD de interesse ladeado por NheI e sítios de restrição BamHI e 5'-fosforilada pode ser ligada em pTox7 (modificado em nosso laboratório pela inserção de um par de base logo após a restrição BamHI ¹⁴ sites) (Figura 3) digerida seqüencialmente com BamHI e NheI. Um oligonucleotídeo exemplo é mostrado abaixo:
   5'ctagcTMDSEQUENCEg3 '
   3 'gTMDSEQUENCEcctag5'

A seqüência deve ser DTM 24/12 resíduos (seqüências mais curtas será presumivelmente alongada por resíduos hidrofóbicos vetor codificado). , A fim de investigar a....

Discussão

O ensaio ToxR repórter transcricional é uma maneira fácil de identificar seqüências transmembrana com potencial para oligomerize. Uma vez que as interações estão ocorrendo dentro da membrana bacteriana interior, este ensaio contorna os problemas associados com a validade de sistemas de estudar na membrana-miméticos ambientes. Dado que a clonagem de DTM múltiplas em um único plasmídeo pode ser facilmente feito em paralelo eo ensaio completo pode ser realizado em formato de 96 poços da placa, este ensaio pode ser usado pa.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Nome do reagente	Companhia	Número de catálogo	Comentários (opcional)
Enzima de restrição BamHI	Invitrogen	15201023	Enzimas Invitrogen foram encontrados para ser mais eficiente do que fornecedores alternativos
NheI enzima de restrição	Invitrogen	15444011	Enzimas Invitrogen foram encontrados para ser mais eficiente do que fornecedores alternativos
15 mL tubos de cultura	Fisher Scientific	14-956-1J
SOC media	Teknova	S0225	Feitas até o volume adequado e esterilizado em autoclave.
Media LB	Sigma-Aldrich	L7275	Feitas até o volume adequado e esterilizado em autoclave.
Cloranfenicol	Sigma-Aldrich	CO 3 78	Solução estoque de 30 mg / mL em etanol armazenados em freezer
Arabinose	Fluka	10839	Solução estoque de 2,5% (w / v) em água armazenado em freezer
Na 2 HPO 4	Sigma-Aldrich	S9390
NaH 2 PO 4	Sigma-Aldrich	S9638
KCl	Mallinckrodt Chemicals	6858-06
MgSO 4 .7 H 2 O	Sigma-Aldrich	63138
Dodecilsulfato de sódio (SDS)	Sigma-Aldrich	L6026
2-nitrofenil β-D-galactopiranosídeo (ONPG)	Sigma-Aldrich	73660
Z-buffer			16,1 g Na 2 HPO 4 5.5g NaH 2 PO 4 0,75 g KCl 0.246g MgSO 4 Até perfazer 1 l, pH 7,0
Z-buffer/chloroform			200 mL β-mercaptoetanol, 2 mL de clorofórmio, faz até 20 mL com Z-buffer. Vortex por 1 min centrífuga, por 1 min a 800 rpm. Faça frescos para cada prato.
Z-buffer/SDS			160 mg SDS dissolvido em 10 mL Z-buffer
Z-buffer/ONPG			40 mg ONPG em 10 mL Z-buffer. Faça frescos para cada placa
β-mercaptoetanol	Calbiochem	444203
Anti-MBP anticorpo monoclonal (HRP conjugado)	NEB	E8038S
Meio mínimo com maltose			1 x sais M9, maltose 0,4%, 1 mg / mL de tiamina, 2 mM MgSO 4
De 96 poços da placa de fundo chato	Sarstedt	83.1835.300
Leitor de placas-	Beckman Coulter	DTX880 Detector Multimodo
Banho de água	VWRI	89032-204
Agitação incubadora	FormaScientific