Mediada por células-linfocitotoxicidade (CML) os ensaios podem ser usados para testar as respostas auto-reativos e mecanismos de estudo de morte celular in vitro. No entanto, usando live-célula confocal técnicas de imagem microscópica com corantes fluorescentes, do tipo e da cinética de morte celular, bem como as vias utilizadas podem ser estudados em maior detalhe.
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Artigo de método
Métodos para avaliar Mediated Beta Morte celular por linfócitos T citotóxicos
Neste artigo
Resumo
Resumo
Diabetes tipo 1 (DM1) é uma doença mediada por células T auto-imunes. Durante a patogênese, os pacientes tornam-se progressivamente mais insulinopenic como a produção de insulina está perdido, presumivelmente, o que resulta da destruição das células beta pancreáticas pelas células T. Compreensão dos mecanismos de morte das células beta durante o desenvolvimento do DM1 irá fornecer informações para gerar uma cura eficaz para esta doença. Mediada por células linfocitotoxicidade (CML) ensaios têm historicamente utilizado o Chromium radionuclídeos 51 (51 Cr) para rotular as células-alvo. Estas metas são, em seguida, expostos a células efetoras e da liberação de 51 Cr a partir de células-alvo é lido como uma indicação de linfócitos mediada por morte celular. Inibidores de resultado morte celular na liberação diminuída de 51 Cr.
Como células efetoras, usamos uma população autoreactive ativado clonal de linfócitos CD8 + T citotóxicas (CTL) isolado de um camundongo transgênico estoque para ambas as cadeias alfa e beta do receptor de células T AI4 (TCR). Ativado AI4 células T foram co-cultivados com células-alvo 51 Cr rotulados NIT por 16 horas, a liberação de 51 Cr foi gravado para calcular a lise específica
Mitocôndrias participar em muitos eventos fisiológicos importantes, como a produção de energia, regulação da transdução de sinalização e apoptose. O estudo da célula beta mitocondrial alterações funcionais durante o desenvolvimento do DM1 é uma área nova de pesquisa. Usando o potencial de membrana mitocondrial corante Rodamina Tetrametil Methyl Ester (TMRM) e imagens de células microscópicas confocal vivemos, nós monitorados potencial de membrana mitocondrial ao longo do tempo na linha da célula beta NIT-1. Para exames de imagem, AI4 células T efectoras foram marcadas com o corante fluorescente coloração nuclear Picogreen. NIT-1 e células T foram co-cultivados em câmaras lamínula e montado sobre o palco microscópio equipado com uma câmara de células vivas, a 37 ° C, com 5% de CO 2, e umidificado. Durante esses experimentos imagens foram tiradas de cada cluster a cada 3 minutos para 400 minutos.
Mais de um curso de 400 minutos, observou-se a dissipação do potencial de membrana mitocondrial em NIT-1 grupos de células, onde AI4 células T foram anexados. No experimento controle simultâneo onde NIT-1 as células foram co-cultivados com MHC desencontradas células Jurkat linfócitos, potencial de membrana mitocondrial permaneceu intacta. Esta técnica pode ser usada para observar em tempo real as mudanças no potencial de membrana mitocondrial em células sob ataque de linfócitos citotóxicos, citocinas, ou outros reagentes citotóxicos.
Protocolo
1. Preparação de células
- Cultura de células alvo: Cultura do mouse linhas de células beta, NIT-1 e NIT-4, foi um 1,2 descrito anteriormente em DMEM suplementado com 10% de SFB, BSA 0,02%, não-essenciais Aminoácidos, 15mM HEPES, 16.5mm Glocose e penicilina / estreptomicina. Por 51 Cr rotulagem, as células de semente em um flat-bottom de 96 poços na placa de cultura 5X10 4 células / poço em 200 mL meio de cultura. Para experimentos de microscopia, as células de semente em um oito bem-Lab-Tak II chambered lamela em 5x10 4 por câmara em 500 mL meio de cultura, e deixe crescer por 48 horas antes de usar nos experiment....
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Discussão
Citotóxica de células T morte celular mediada beta está a fisiopatologia das principais DM1 5. CML ensaios utilizando 51 Cr lançamento nos permitem estudar o grau de meta-efetoras de resposta 6. No entanto, o processo detalhado e os caminhos da morte das células T mediada por células beta ainda não é totalmente compreendido. Uma vez que as mitocôndrias são críticos para a função das células beta ea morte 7, centrada em mudanças mitocondrial durante a CML visual. Dissipação de .......
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Divulgações
Experimentos em animais foram realizados de acordo com as diretrizes e regulamentos estabelecidos pela Universidade da Flórida Animal Care Institucional e Comitê de uso.
Agradecimentos
Este trabalho foi financiado por subvenções dos Institutos Nacionais de Saúde e DK074656 AI56374 (CEM), bem como o Juvenile Diabetes Research Foundation.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Nome do reagente | Companhia | Número de catálogo | Comentários (opcional) |
| Cr-51 | Perkin Elmer | NEZ030500IMC | |
| PBS | Cellgro | 21-040-60 | |
| Tetrametil Rodamina Methyl Ester (TMRM) | Invitrogen | T668 | |
| Picogreen | Invitrogen | P7581 | |
| AI4 mimotope | mimotopes.com | seqüência de aminoácidos: YFIENYLEL | |
| IL-2 | R & D | 485-MI | |
| DMEM | Invitrogen | 11885 | |
| FBS | HyClone | SH30071.03 | |
| Albumina de soro bovino | Sigma | A8412 | |
| HEPES | Cellgro | 25-060-Cl | |
| MEM Non-Aminoácidos Essenciais | GIBCO | 11140 | |
| Penicilina / estreptomicina | Gêmeos | 400-109 | |
| Vermelho de fenol livre de DMEM | Sigma | D5303 | |
| Incubadora de CO2 | Thermo Fisher | HeraCell 150i | Mantido estéril para cultura de células |
| Cabines de segurança biológica | Thermo Fisher | Forma 1440 | |
| Descartáveis tubos de cultura, 6x50 milímetros de vidro Lime | Pescador | 14-958-A | |
| Contador gama | Perkin Elmer | Assistente de contador gama automático 1470 | |
| Microscópio confocal | Zeiss | LSM 510 Meta Confocal | Com estágio motorizado e câmara de células vivas |
| Pipeta (1ml, 200μl, 20μl, 10μl, 2μl) | Eppendorf | ||
| Tubos (Amber) | Pescador | 50819772 | |
| Centrifugador | Sorvall Legend RT + | 75004377 | |
| Hemocitômetro | Fisher Scientific | 267110 | |
| Microscópio na posição vertical | Zeiss | Axioskop40 | |
| NOD.Cg-RAG1 tm1Mom Tg (TcraAI4) 1Dvs/DvsJ Ratos | O Laboratório de Jackson | 004347 | |
| NOD.Cg-RAG1 tm1Mom Tg (TcrbAI4) 1Dvs/DvsJ Ratos | O Laboratório de Jackson | 004348 | |
| NOD-AI4α / β camundongos F1 | N / A | N / A | UF criados em instalações para animais |
Referências
- Hamaguchi, K., Gaskins, H. R., Leiter, E. H. NIT-1, a pancreatic beta-cell line established from a transgenic NOD/Lt mouse. Diabetes. 40, 842-849 (1991).
- Chen, J., Gusdon, A. M., Piganelli, J., Leiter, E. H., Mathews, C. E. mt-Nd....
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Reimpressões e permissões
