Na eletroporação útero permite a entrega rápida em um gene espacialmente e temporalmente maneira controlada no desenvolvimento do sistema nervoso central (SNC). Aqui nós descrevemos um adaptável altamente in utero protocolo de eletroporação que pode ser usado para entregar constrói expressão em vários domínios embrionário do SNC, incluindo o telencéfalo diencéfalo e retina.
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Artigo de método
Entrega Gene eficiente em múltiplos territórios CNS Usando In Utero Eletroporação
Neste artigo
Resumo
Resumo
A capacidade de manipular a expressão genética é a pedra angular da moderna embriologia experimental dias, levando para a elucidação de múltiplas vias de desenvolvimento. Vários poderosos e bem estabelecida tecnologias transgênicas estão disponíveis para manipular os níveis de expressão gênica no mouse, permitindo a geração de ambos os perda e ganho de função-modelos. No entanto, a geração de transgênicos do mouse é tanto caro e demorado. Métodos alternativos de manipulação genética, portanto, sido amplamente procurado. In utero eletroporação é um método de entrega de genes em embriões de ratos vivem 1,2 que temos adaptado com sucesso 3,4. É em grande parte baseada no sucesso de tecnologias na eletroporação in ovo que são comumente usados em pinto 5. Resumidamente, o DNA é injetado no ventrículos aberta do cérebro em desenvolvimento ea aplicação de uma corrente elétrica provoca a formação de poros transitórios na membrana celular, permitindo a absorção de DNA na célula. Em nossas mãos, os embriões podem ser eficientemente electroporated logo dia embrionário (E) 11,5, enquanto a segmentação de embriões mais jovens exigiria uma ultra-sonografia protocolo de microinjeção, como descrito anteriormente 6. Por outro lado, E15.5 é a última fase, pode facilmente electroporate, devido ao aparecimento de parietal e diferenciação osso frontal, o que dificulta microinjeção no cérebro. Em contraste, a retina é acessível através do fim da embriogênese. Embriões podem ser coletados em nenhum momento durante o período embrionário ou pós-natal precoce. Injeção de uma construção repórter facilita a identificação de células transfectadas.
Até à data, em eletroporação utero tem sido mais utilizado para a análise do desenvolvimento neocortical 1,2,3,4. Estudos mais recentes têm como alvo a retina embrionária 7,8,9 e tálamo 10,11,12. Aqui, apresentamos uma modificação no útero protocolo de eletroporação que pode ser facilmente adaptado a diferentes domínios alvo do SNC embrionárias. Nós fornecemos evidências de que usando esta técnica, podemos atingir o embrionárias telencéfalo diencéfalo e retina. Resultados representativos são apresentados, primeiro mostrando o uso desta técnica para introduzir DNA construções de expressão para os ventrículos laterais, o que nos permite monitorar a maturação de células progenitoras, diferenciação e migração no telencéfalo de embriões. Também mostramos que esta técnica pode ser usada para DNA-alvo para os territórios diencefálica em torno do 3 º ventrículo, permitindo que as rotas migratórias de diferenciar neurônios em núcleos diencefálica a ser monitorado. Finalmente, nós mostramos que o uso de micromanipuladores nos permite com precisão introduzir DNA construções em áreas-alvo de pequeno porte, incluindo o espaço sub-retiniano, permitindo-nos analisar os efeitos de manipular a expressão genética no desenvolvimento da retina.
Protocolo
1. Set-up
- Set-up área cirúrgica, como mostrado na figura. 1A, A '. Componentes-chave do set-up incluem um Eppendorf FemtoJet microinjetor, Narishige micromanipulador com porta-agulha, steromicroscope Leica, sistema de fibra ótica de iluminação, 830 ECM Sistema de Eletroporação Onda Quadrada com eletrodos, almofada de aquecimento e um vaporizador de anestésico isoflurano.
- Limpe todas as ferramentas com um líquido de limpeza ultra-sônica utilizando Bransonic Metriclean2 solução pouca espuma para sonicando instrumentos cirúrgicos. Esterilizar instrumentos em autoclave. Ferramentas esterilizados são então mantidos em Germex.
- Prepare seringa....
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Discussão
Eletroporação in utero pode ser usado para analisar uma ampla variedade de processos de desenvolvimento. Por exemplo, a transfecção de genes repórter, como GFP, mCherry ou fosfatase alcalina pode ser usado para conduzir linhagem rastreamento e experiências de migração neuronal. Alternativamente, Cre recombinase pode ser transitoriamente expressa seletivamente eliminar um alelo floxed em um espacialmente e / ou temporalmente controlada maneira. Além disso, shRNA ou dominante constrói negativo pode ser electropor.......
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Divulgações
Não há conflitos de interesse declarados.
Agradecimentos
Os autores gostariam de agradecer a Eva Hadzimova, Pierre Mattar e Christopher Kovach pelo seu trabalho inicial no estabelecimento in utero tecnologia eletroporação no laboratório CS. Este trabalho foi financiado por um Instituto Canadense de Pesquisa em Saúde (CIHR) conceder (MOP 44.094) e CIHR / Foundation Fighting Blindness (FFB) Emerging Equipe Grant (00933-000) para CS e uma crianças de Alberta Hospital Research Foundation Grant para DMK. RD foi apoiado por uma bolsa de estudos Esperança CIHR Canadá, RC é apoiado por um Studentship FFB e LML foi apoiado por uma bolsa de formação CIHR em Genética e Desenvolvimento Infantil.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Nome do reagente | Companhia | Número Catálogo | Categoria |
| Tesoura fina | Belas Ciência Ferramentas Inc. | 14078-10 | Ferramentas cirúrgicas |
| Iris tesoura, curvas | Belas Ciência Ferramentas Inc. | 14061-10 | Ferramentas cirúrgicas |
| Olsen-Hegar Porta Agulha Ex-Delicate | Belas Ciência Ferramentas Inc. | 12002-12 | Ferramentas cirúrgicas |
| Anel de fórceps, 9mm | Belas Ciência Ferramentas Inc. | 11103-09 | Ferramentas cirúrgicas |
| Olho vestir Pinça | Belas Ciência Ferramentas Inc. | 11051-10 | Ferramentas cirúrgicas |
| Dumont # 7 DMX Pinça | Belas Ciência Ferramentas Inc. | 11271-30 | Ferramentas cirúrgicas |
| Dumont # 5 DMX Pinça | Belas Ciência Ferramentas Inc. | 11251-30 | Ferramentas cirúrgicas |
| Tecidos fórceps-Adson | Belas Ciência Ferramentas Inc. | 11027-12 | Ferramentas cirúrgicas |
| Reflex Aplicador Clipe | Instrumento de precisão mundo | 500343 | Ferramentas cirúrgicas |
| Colher perfurada, 15 mm de diâmetro | Belas Ciência Ferramentas Inc. | 10370-18 | Ferramentas cirúrgicas |
| Remover Autoclip | Mikron | 427637 | Ferramentas cirúrgicas |
| De seda preta trançada Suture | Ethicon Inc. | K871 | Ferramentas cirúrgicas |
| Reflexo da pele fechamento da ferida inoxidável Aço Clips | Precision Instruments mundo | 500346 | Ferramentas cirúrgicas |
| ECM 830 Praça Sistema de Eletroporação Onda | VWR-CanLab | 58018-004 | Instrumentos |
| Pinças w / Variável Gap Round 2 Eletrodo Placa 5 milímetros Platinum | Protech International Inc. | CUY650P5 | Instrumentos |
| Pinças w / Variável Gap Round 2 Eletrodo Placa 7 milímetros Platinum | Protech International Inc. | CUY650P7 | Instrumentos |
| Eppendorf FemtoJet microinjetor | VWR CanLab | CA62111-488 | Instrumentos |
| Controle pé para Eppendorf FemtoJet microinjetor | VWR CanLab | CAACCESS (misc.) | Instrumentos |
| Modelo Cleaner Bransonic ultra-1510R-DTH | VWR CanLab | CA33995-534 CPN-952-118 | Instrumentos |
| Sutter P97 micropipeta Puller | Sutter Instrumento, Carsen Group Inc. | P-97 | Instrumentos |
| Micropipetas - borosilicato com filamento OD: 1mm, ID: 0,78 mm, 10 cm de comprimento | Instrumento Sutter | BF100-78-10 | Instrumentos |
| 3 Axis-Manipulator Grosso | Carl Zeiss Canada Inc. | M-152 | Instrumentos |
| Dispositivo de fixação magnética para micromanipulador | Precision Instruments mundo | M1 | Instrumentos |
| Aço Base Plate para micromanipulador | Precision Instruments mundo | 5052 | Instrumentos |
| Titular micropipeta | Pr mundoInstrumentos ECISÃO | MPH3 | Instrumentos |
| Micropipeta Handle | Precision Instruments mundo | 5444 | Instrumentos |
| Estereomicroscópio | Leica | MZ6 | Instrumentos |
| Vaporizador de anestésico isoflurano | Porter Instruments Company | MODELO 100-F | Instrumentos |
| Metriclean2 solução pouca espuma para sonicando instrumentos cirúrgicos | Metrex Research Corporation | 10-8100 | Reagentes cirúrgicos |
| Gentamicina 40mg/ml em 0,2 g de spray azul de metileno de antibióticos após a sutura | Sigma Aldrich | G1264 | Reagentes cirúrgicos |
| Germex para esterilizar instrumentos cirúrgicos | Vétoquinol | DIN # 00141569 | Reagentes cirúrgicos |
| BNP pomada oftálmica | Vétoquinol | DIN # 00516414 | Reagentes cirúrgicos |
| Nair ® | Distribuído por Church & Dwight Co., Inc. | comercialmente disponíveis | Reagentes cirúrgicos |
| Stanhexidine limpador de pele 4% w / v | Omega Laboratories Inc. | 01938983 | Reagentes cirúrgicos |
| Buprenorfina analgésico (Temgesic) | Schering-Plough | 531-535 | Reagentes cirúrgicos |
| Sulfa "25" de antibióticos orais sulphamethazine | Professional Veterinary Laboratories | DIN # 00308218 | Reagentes cirúrgicos |
| Solução de Ringer com lactato | Baxter Corporação | DIN # 0061085 | Reagentes cirúrgicos |
| Saline - cloreto de sódio a 0,9% | B-Braun Medical Inc. | DIN # 01924303 | Reagentes cirúrgicos |
| Inalação Anestésica - USP isoflurano | Parceiros farmacêutica do Canadá Inc. | DIN # 02237518 | Reagentes cirúrgicos |
| Fast Green FCF | Sigma-Aldrich | F7252 | Reagentes cirúrgicos |
Referências
- Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Dev Biol. 240, 237-246 (2001).
- Takahashi, M., Sato, K., Nomura, T., Osumi, N. Manipulating gene expressions by electroporation in ....
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Reimpressões e permissões
