Neste vídeo mostramos a preparação de E18 neurônios de rato Cortical.
Artigo de método
Preparando E18 neurônios de rato para Cortical Compartimentação em um dispositivo micro
Neste artigo
Resumo
Resumo
Neste vídeo, demonstramos a preparação de E18 neurônios de rato cortical. E18 neurônios de rato cortical são obtidos a partir E18 córtex do rato fetal previamente dissecados e preparados. O córtex é E18, à dissecção, imediatamente dissociado em neurônios individuais. É possível armazenar E18 córtex em Hibernate tampão contendo B27 E a 4 ° C por até uma semana antes da dissociação é realizada. No entanto, haverá uma queda na viabilidade celular. Normalmente obtemos o nosso E18 Cortex fresco. Ele é transportado para o laboratório em gelo frio livre de buffer Cálcio Magnésio dissecção livre (CMFM). Após a chegada, a tripsina é adicionado ao córtex para uma concentração final de 0,125%. O córtex é, então, incubados a 37 ° C por 8 minutos. DMEM contendo 10% FBS é adicionado ao córtex para parar a reação. O córtex é então centrifugado a 2500 rpm por 2 minutos. O sobrenadante é removido e 2 ml de Neural Mídia Basal (NBM) que contenha 2% B27 (vol / vol) e 0,25% Glutamax (vol / vol) é adicionado para o córtex, que é então re-suspenso por pipetando para cima e para baixo. Em seguida, o córtex é triturado previamente fogo com pipetas de vidro polido, cada um com uma abertura sucessivas menores. Após trituração, o córtex é mais uma vez centrifugado a 2500 rpm por 2 minutos. O sobrenadante é então removido eo pellet córtex re-suspenso com 2 ml de NBM contendo B27 e Glutamax. A suspensão de células é então passado através de um filtro de células 40 hum nylon. Em seguida as células são contadas. Os neurônios estão agora prontos para carregar no dispositivo micro neurônio.
Protocolo
Preparando E18 neurônios de rato Fetal Cortical para Compartimentação
Antes de começar, é importante para aquecer todos os meios necessários e reagentes para 37 ° C.
Também é importante para esterilizar tudo o que é usado para preparar as células (por exemplo, lâmpadas de borracha, suportes de tubos, frascos de mídia, etc), e aquilo que é colocado na capa, limpando-se com etanol 70%.
- Coloque dois pedaços de E18 Cortex Rato Fetal (um cérebro, previamente dissecado) em um tubo de 15 ml contendo 1 ml gelada de cálcio sem magnésio livre de buffer de dissecção.
- Adicionar 1 ml de 0,25% Tripsina-EDTA para o córtex em tampão dissecção, elevando o volume final de 2 ml de tripsina e concentração final de 0,125%.
- Colocar o tubo de 15 ml em um banho de água 37 ° C por 8 minutos.
- Durante este tempo, o fogo polonês 3 pipetas de vidro Pasteur, formando aberturas sucessivamente menores, em um armário de biossegurança para ajudar a manter a esterilidade.
- Após a incubação 8 minutos do córtex, adicione 10 ml de DMEM contendo 10% FBS para o córtex para ajudar a parar a reação de tripsina.
- Centrifugar o tubo contendo 15 ml do córtex e DMEM/10% FBS a 2500 rpm por 2 minutos.
- No armário de biossegurança, remover o sobrenadante do córtex usando um copo pipeta Pasteur com sucção a vácuo em anexo. Tenha cuidado para não perturbar ou deslocar o pellet.
- Adicionar 1 ml da NMB ao pellet córtex e gentilmente pipeta cima e para baixo. É muito importante para evitar a criação de bolhas de ar enquanto pipetagem cima e para baixo, como as bolhas de ar podem danificar as células por oxidação.
- Use o fogo-polido pipeta Pasteur com a mais ampla abertura para triturar o córtex, anexando um bulbo de borracha estéreis até o fim e pipetagem cima e para baixo 5 vezes, novamente tomando cuidado para não introduzir bolhas de ar. Continue esse processo com as outras duas pipetas de vidro, cada uma com um tamanho de abertura diminuiu.
- Após a trituração, centrifugação as células novamente a 2500 rpm por 2 minutos.
- Após a centrifugação, uma vez remover o sobrenadante e ressuspender o pellet celular em 2 ml de NBM.
- Filtrar a solução de células ressuspenso através de um filtro de células 45 um.
- Mancha as células com Trypan Blue, contados, e carregado no dispositivos. Normalmente, carga de 20 ul de células por dispositivo.
Nota: a concentração final de células é tipicamente entre 2,5 milhões de células / ml e 8 milhões de células / ml
Carregando as células
Depois que as células foram contadas, é hora de carregar as pilhas no dispositivo:
- Traga os dispositivos previamente preparado contendo NBM para a cabine de segurança biológica para manter a esterilidade.
- Retire o excesso de mídia dos poços por sucção a vácuo. No entanto, ter cuidado para evitar a remoção de todos os meios de comunicação - deve haver alguns meios de comunicação no canal principal.
- Aplicar 20 ul de células para o reservatório superior esquerdo do dispositivo (veja o diagrama se necessário). O fluxo de células dentro do dispositivo e anexar à superfície PLL tratada.
- Depois de carregar, colocar os dispositivos contendo células de volta em uma incubadora por 10 minutos para permitir que as células para anexar.
- Após 10 minutos, preencher os reservatórios com a mídia e dispositivos lugar de volta na incubadora.
Discussão
Densidades de células pode ser variado, dependendo da aplicação. No entanto, a semeadura em neurônios primários muito baixa de uma densidade normalmente leva à morte celular. Dependendo da incubadora e do nível de umidade, a mídia pode ter de ser alterado nos dispositivos a cada 2 a 3 dias. Ao mudar de mídia, é importante após a remoção da mídia a partir dos reservatórios, para nunca remover a mídia dos canais principais. Além disso, é boa prática colocar novas mídias nos poços superior e permitir que alguns meios de comunicação fresca a fluir através do dispositivo e para os principais canais antes de encher todos os reservatórios.
Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários | |
|---|---|---|---|---|
| NBM | meio | Invitrogen | 21103-049 | O meio basal neural é obtido da Invitrogen por meio de sua linha Gibco de reagentes para cultura celular. |
| Embriões de ratos E18 | Animal | Obtidos de ratas prenhes da linhagem Sprague Dawley. A rata prenhe é sacrificada e os filhotes de rato fetais E18 são dissecados para obter o córtex fetal de rato E18. | ||
| Tampão de dissecção HBSS sem cálcio e sem magnésio (CMFM) | tampão | Tampão de dissecção HBSS sem cálcio e sem magnésio, mantido sob refrigeração. | ||
| Tubo de 15 ml | Ferramenta | BD Biosciences | Falcon No. 352097 | Disponível através do catálogo Fisher Scientific número 14-959-70C |
| Tripsina-EDTA 0,25% | Reagente | Invitrogen | ||
| Banho-maria a 37˚C | ||||
| Pipetas de Pasteur | Fisher Scientific | de vidro | ||
| DMEM | meio | Invitrogen | ||
| FBS | Reagente | Invitrogen | soro, utilizado a 10% no DMEM | |
| centrífuga | ajustada para 2500 rpm | |||
| Azul de tripano | Invitrogen | para contagem de células vivas/mortas | ||
| Filtro celular BD Falcon de 40 µm | Ferramenta | BD Biosciences | Falcon cat# 352340 | Disponível através da Fisher Scientific. Catálogo Fisher# 08-771-1 |
| B27 | Reagente | Invitrogen | 17504-044 | O B27 é um suplemento comercial disponível pela Invitrogen por meio de sua linha Gibco de reagentes para cultura celular. |
| Glutamax | Reagente | Invitrogen | 35050-061 | O Glutamax está disponível pela Invitrogen por meio de sua linha Gibco de reagentes para cultura celular. |
Referências
- Park, J. W., Vahidi, B., Taylor, A. M., Rhee, S. W., Jeon, N. L. Microfluidic culture platform for neuroscience research. Nat Protoc. 1, 2128-2136 (2006).
- Taylor, A. M., Blurton-Jones, M., Rhee, S. W., Cribbs, D. H., Cotman, C. W., Jeon, N. L. A microfluidic culture platform for CNS axonal injury, regeneration and transport. Nat Methods. 2, 599-605 (2005).
Reimpressões e permissões
