Humano In Vitro Supressão como ferramenta de triagem para o reconhecimento de um Estado precoce de desequilíbrio imunológico

Resumo

Tregs são potentes supressores do sistema imune. Há uma falta de marcadores de superfície única para defini-los, portanto, definições de Tregs são principalmente funcionais. Aqui nós descrevemos um otimizado In vitro Teste capaz de identificar o desequilíbrio imunológico em indivíduos em risco de desenvolver DM1.

Resumo

Células T reguladoras (Tregs) são mediadores críticos de tolerância imune a auto-antígenos. Além disso, eles são reguladores fundamentais da resposta imune após uma infecção. Apesar dos esforços para identificar marcador de superfície única sobre Tregs, a única característica única é a sua capacidade para suprimir a proliferação e função das células T efectoras. Embora seja claro que só em ensaios in vitro podem ser utilizados na avaliação da função Treg humano, este torna-se problemático quando se avalia os resultados de estudos transversais, onde as células saudáveis ​​e células isoladas de indivíduos com doenças auto-imunes (como Diabetes Tipo 1-DM1) precisam a serem comparados. Há uma grande variabilidade entre laboratórios no número e tipo de células T responder, a natureza e força de estimulação, Treg: rácios de resposta eo número e tipo de células apresentadoras de antígenos (APC) usado em humanos em testes de supressão vitro. Esta variabilidade dificulta a comparação entre os estudos que medem a função Treg difícil. O campo precisa de um ensaio de Treg supressão padronizados que vai funcionar bem com ambos os indivíduos saudáveis ​​e aqueles com doenças auto-imunes. Nós desenvolvemos um ensaio in vitro em supressão que mostra muito pouco da variabilidade intra-ensaio na estimulação de células T isolados de voluntários saudáveis ​​em comparação a indivíduos com base destruição auto-imune do pâncreas β-células. O objetivo principal desta peça é descrever um ensaio in vitro que permite a supressão humana comparação entre grupos de sujeitos diferentes. Além disso, este ensaio tem o potencial para delinear uma pequena perda em função nTreg e antecipar ainda mais a perda de, no futuro, assim, identificar temas que poderiam se beneficiar da terapia com imunomoduladores preventiva ^1. Abaixo, fornecemos descrição detalhada das etapas envolvidas neste procedimento. Esperamos contribuir para a padronização do ensaio in vitro em supressão usado para medir a função Treg. Além disso, oferecemos este ensaio como uma ferramenta para reconhecer um estado inicial de desequilíbrio imunológico e um biomarcador em potencial funcional para DM1.

Protocolo

1. Antes de configurar supressão de um ensaio, um precisa de contas de revestimento tosylactivated com anti-CD3 humano (clone UCHT1, 1μg/ml concentração final) para a estimulação das células e, depois, verificar se as contas são eficientemente revestido através da criação de um ensaio de proliferação in vitro utilizando humana células T

1. Tomar 1ml de M-450 contas tosylactivated do frasco original, realizada em suporte magnético e segure até que todas as contas tenham aderido ao lado do tubo. Remova o tubo de buffer enquanto ainda está no suporte magnético. Leve tubo de suporte magnético e adicionar 1 ml de buffer1, coloque o tubo no suporte magnético novamente e remover o buffer1 enquanto tubo está no suporte magnético; contas ressuspender em 1 ml de buffer1 e adicionar 40μl de anti-CD3 humano, agite a 37 ° C por 15 minutos, adicionar 0,1% w / v BSA e continuar agitando para o próximo 16 horas.
2. Lave as contas em buffer2 duas vezes durante 5 minutos a 2-8 ° C e de vez em buffer3 por 5 minutos a 2-8 ° C usando suporte magnético, como explicado acima; remover o tampão e ressuspender as contas em 1ml de buffer2; as contas são concentração de 4x10 ⁸ ml / final e pronto para uso.
3. Alíquota de 50.000 e 25.000 PBMC / poço, em triplicata em placa de 96 poços e adicione número variável de CD3-revestido contas (4x10 ⁸ contas / ml, CD3 1μg/ml, por exemplo 1, 2, 3, 4, 5 esferas / células ), a fim de determinar o número ideal de contas por célula. Após 72 horas de cultura, adicionar 1μCi ^[3 H] timidina e continuar incubando a 37 ° C para os próximos 16 horas. Células colheita em chapa de colheita Multiscreen (Millipore), adicione líquido de cintilação e ler contagens por minuto (cpm) / poço usando Top Conde NXT (Packard, CT). Use as contas / razão entre células quando CPMs são acima de 5000, mas menos de 15 mil para evitar a superestimulação de Tregs, que pode perder função supressiva. Normalmente, a razão de 3 esferas / células estimula tanto responder e células Treg em todos os grupos sujeitos testados até agora ^1-4.

2. PBMC isolamento do sangue total de doadores saudáveis ​​ou de leukopacks humano ou buffy coat (BC), geralmente tiradas de voluntários saudáveis ​​e disponível gratuitamente a partir de centros de transfusão de sangue locais (Figura 1)

1. Diluir o BC (~ 50ml) 1:06 com PBS (adicione 250ml). Agora não há volume total de 300ml. Lentamente camada de 25ml de BC diluída em cima de 15ml Ficoll-Paque PLUS adicionado 50ml tubos Falcon, sem perturbar as camadas. Centrifugar a 800xg (1400 rpm em uma centrífuga Sorvall com rotor girando balde SH-3000) por 30 minutos a 4 ° C, com freios desligado.
2. Recolher com cuidado a camada de PBMC (fase intermediária) e transferi-lo para uma nova 50ml tubos Falcon. Lavar PBMC preenchendo os tubos de até 50ml com DPBS. Coletar 2 pellets de células em um tubo. Centrifugar a 400xg por 10 min a 4 ° C. Repita o passo de lavagem duas vezes, cada vez que combina dois pellets de células em um tubo único. Combine todos os pellets de células em um tubo de 50ml único.
3. Contagem de PBMC usando Trypan teste de exclusão Azul. Fazer uma diluição de 1:10 em Trypan Blue adicionando 20μl de PBMC de 180μl de Trypan Blue mancha. Misture bem e leve 20μl a contar em hemocitômetro imediatamente. Contar números de todas as células sem mácula e apenas azul manchado localizados em dois blocos quadrados cada um contendo 16 quadrados menores. Tomar a média dos dois números e multiplicar por 10. Divida este número por 100 para obter o número de PBMC / ml. Porcentagem de células viáveis ​​calcular como [1 - (número de células azuis / número de células total) x100]. Proceder se a viabilidade é ≥ 95%.

3. MACS tipo pré-CD4 células T

1. Antes de prosseguir, a transferência de 1 ml de PBMC em um novo tubo, adicionar 4ml de mídia para preparar células de irradiação com 5000rad-estes serão células apresentadoras de antígenos (APC).
2. Centrifugar o resto das células em 250xg em PBS/2mM tampão BSA EDTA/0.5% por 10 min a 4 ° C. Deitar fora o sobrenadante de células, e ressuspender em 4ml de tampão BSA PBS/2mM EDTA/0.5%.
3. Adicionar 200μl de microesferas de MACS anti-CD4 e incubar a 4 ° C por 20 minutos.
4. Lavagem adicionando 40 ml de tampão BSA PBS/2mM EDTA/0.5% e centrifugar a 250xg de 10min a 4 ° C. Deitar fora o sobrenadante e ressuspender em 8ml de desgaseificado à temperatura ambiente, PBS/2mM EDTA/0.5% tampão BSA.
5. Filtro-separada de suspensão da célula usando filtros pré-separação antes de carregá-los em uma coluna de LS.
6. Dividir a suspensão de células e 4ml camada de cada coluna LS mais calibrada (com 3 ml de tampão BSA deggassed PBS/2mM EDTA/0.5%). LS coluna é fixa no separador MidiMACS. Antes de suspensão celular se esgota, ou fluxo contínuo re-run ou adicionar 3 ml de temperatura ambiente deggassed PBS/2mM EDTA/0.5% tampão BSA e deixar que o tampão de corrida completamente. Adicione mais buffer até que ele sai claro.
7. Pipetar 5 ml tampão deggassed na coluna LS, LS remover Coluna do separador MidiMACS e coloque em um tubo de nova coleção estéril 15ml deixar ~ 1,0 ml por rodar. Coloque o êmbolo na coluna e empurre lentamente o resto dode volume para fora.
8. Faça o mesmo com as duas colunas LS e combinar as duas CD4 + frações. Adicione até 50ml células PBS e contar. Rendimento esperado é de até 5x10 ⁸ células. Centrifugar a 400xg por 10 minutos e ressuspender as células bem em 2ml PBS/2mM tampão BSA EDTA/0.5%.

4. Fluorescente ativado Celular classificação de isolamento (FACS) (Figura 2)

1. Faça um coquetel de anticorpos para marcadores de CD para os marcadores de células seguintes superfície (manter protegido da luz): 20 l de anti-humano CD8-FITC (clone RPA-T8), 20 l de anti-CD14 humano-FITC (clone M5E2; LPS receptor), 20 l de anti-CD32 humano-FITC (clone FLI8.26; FcγR do tipo II) e 6 mL de anti-humano CD116-FITC (clone M5D12; GM-CSFRα cadeia) e, alternativamente, adicionar anti 40μl -humanas CD4-APCCy7 (clone RPA-T4).
2. Tome 5μl de suspensão de células de 2ml e mancha com 2μl de cocktail mancha, que é um tubo para determinar o limiar (Fluorocromo Minus One-FMO) ^5.
3. Adicionar 50 ul de anti-CD25 humano-PE (clone M-A251; IL-2Rα) para o coquetel de mancha, e adicione o cocktail de suspensão de células e incubar a 4 ° C 30 minutos. Lavar as células em tampão PBS, centrifugue a 400xg por 10 minutos e ressuspender as células a uma concentração de células de 10 ⁷ / ml.
4. Prepare células imaculada e células ou grânulos corados com fluorocromo único para usar como controle de compensação para separação de células em FACS Aria (BD Biosciences, San Jose, NJ).
5. Aquisição de células no tubo FMO que permitirá ao usuário definir o limite para a classificação de células CD25 + T (Figura 2a). Definir uma porta em torno FITC-negativos para excluir as células-FITC células positivas compreendendo monócitos, macrófagos e todos os outros CD4 + T-não-células (Figura 2b).
6. Em um lote separado, desenhar portas para CD25, CD25low e T-CD25high células Tregs (top 1% das células que expressam o maior número de CD25) (Figura 2c). Subpopulações de células normalmente apresentam alta pureza (Figura 2d, 2e e 2f).
7. Centrifugar tubos de coleta com células em 400xg por 10 minutos e mantê-los no gelo até placas.

5. Criar cultura de células em placa de 96 poços (esquema anexado como Table1) em 200μl/well

1. 50μl alíquota de CD3-revestido contas (1 mg / ml), calculado a ser três esferas / resposta celular em um poço, ressuspenso em media completo com 10% de soro AB humanos agrupados em U bottom-placas de 96 poços. (Por exemplo, para fazer media com 2ml CD3-revestido, tomar 7.5μl do estoque de CD3-revestido contas-final 4x10 concentração ⁸ ml / e diluir em 2 ml de mídia, cada 50μl conterá 75.000 beads-3beads/cell).
2. Diluir APC irradiada para 5x10 concentração celular ⁵ ml / e adicionar 50μl (conterá 2,5 x 10 ⁴ células) em cada poço com estimulação previamente adicionados, incluindo poços rotulados como "Tregs só", "A APC só" e "media apenas" na Tabela 1.
3. Adicionar 2,5 x 10 ⁴ / CD4CD25 bem-T ou células CD4CD25low em triplicatas seguinte projeto na Tabela 1.
4. Adicionar Tregs para co-culturas (linha B, Tabela 1) na proporção 01:10 (2.500 células Treg) e poços rotulados como "Tregs only" e incubar a placa a 37 ° C em incubadora de CO ₂ com 5% de CO ₂ , na umidade saturada por 72 horas.
5. Pulso de poços com 1μCi ^[3 H] timidina e continuar incubação a 37 ° C para o próximo 16 horas.

6. Colheita e contando

1. Células colheita na placa colheita multiscreen usando Packard filtermate colheitadeira ou sistema alternativo.
2. Adicionar líquido de cintilação (Microscint 20), tampa colheita placa com a cobertura de plástico transparente, em preparação para a etapa final.
3. Leia contagens por minuto (cpm) / poço usando Top Conde NXT (Packard, CT) ou sistema alternativo.

7. Porcentagem de supressão de computação

1. Como as células foram cultivadas em triplicatas, a média é calculada para cada condição. Se o coeficiente de variação é> 30%, o outlier é eliminado e apenas cpm a partir de dois poços são em média. Porcentagem de supressão é obtida pelo cálculo [(sc) / s] x 100%, onde s = cpm em cultura única e c = cpm em co-cultura.
2. Como naïve (CD25) e in vivo ativado (CD25low) células T efetoras são banhados como células T responder, a diferença na capacidade de Tregs para suprimir a cada um desses subconjuntos é capturado e usado como um indicador de prognóstico potencial funcional baseada na premissa de que células ativadas são mais difíceis de suprimir.

8. Resultados representativos:

Grande variabilidade nos métodos utilizados e os resultados derivados do ensaio in vitro em supressão humana nos levou a realizar um estudo abrangente das condições que influenciam o ensaio ^1. Temos desenvolvido um ensaio que os testes não só a função Treg, mas também a sua pureza, considerando a baixa relação entre Tregs: Teffs (1:10), que determinou anteriormente ^6. Além disso, diferem em Tregs ªeir capacidade de suprimir com sucesso ingênua e vivo em células T ativadas, mesmo em indivíduos saudáveis, como mostrado na Figura 3 e em nossos estudos anteriores ^2,4, que se torna mais proeminente se o equilíbrio imunológico está comprometido, como em indivíduos em risco de desenvolver DM1 . O ensaio funcionou muito bem no estudo onde comparou a função de supressão de recursos naturais (nTregs), induzível (iTregs) e em nTregs vitro expandido, permitindo-nos comparar a sua função entre o controle saudável, de início recente (RO) e DM1 de longa data (LS ) indivíduos DM1. Concluiu-se que assuntos RO DM1 tinham melhor capacidade de gerar funcional tanto iTregs e nTregs expandiu em comparação com indivíduos controle LS DM1 e saudável ^7. Assim, este ensaio pode ser usado como uma excelente ferramenta para o reconhecimento tanto do Estado uma precoce e tardia de desequilíbrio imunológico.

Esquema de apresentação esquemática uma das etapas envolvidas no ensaio in vitro em supressão

Figura 1. Etapas do ensaio in vitro em supressão apresentados com fotografias

Figura 2. Estratégia Gating FACS em isolamento celular. a) CD25 limite + foi ajustada de acordo com Fluorocromo Minus One (FMO), b) as células foram fechadas como FITC-negativos, c) FITC-negativos células foram novamente fechados e recolhidos como CD + CD25-, CD + CD25low e CD + CD25high ( Tregs) mostrada com porcentagens, d) FACS classificadas Tregs após a triagem, e) FACS classificadas CD + CD25low após a triagem, e f) FACS CD4 + CD25-classificadas células T após triagem

Figura 3. Os resultados representativos de indivíduos saudáveis ​​a) Os resultados representativos de contagens por minuto (cpm) de indivíduos saudáveis ​​apresentado como único para todas as culturas de células subconjuntos envolvidos (naïve-CD25-, in vivo ativado-CD25low, células apresentadoras de antígenos-APC e células T reguladoras-Treg), bem como co-culturas de células de resposta T (CD25 ou CD25low) e Tregs. b) Percentagem de supressão de cada CD25 e células T CD25low responder por Tregs autólogo é apresentado para controle de indivíduos saudáveis ​​(n = 4). Supressão foi calculada como [(sc) / s] x 100%, onde s = cpm em cultura única e c = cpm em co-cultura. Embora pequena diferença na capacidade de Tregs para suprimir as células T responder foi notado, não foi significativa (teste t pareado p = 0,08). C) Apresentado são cpm em indivíduos de risco para cada cultura única, incluindo-CD25 e CD25low como responder células T, bem como a APC e Tregs, e co-culturas, onde cada resposta subconjunto de células T é semeado com Tregs Percentagem (CD25-/Tregs e CD25low/Tregs). d) de supressão de cada CD25 e CD25low células T responder por autólogo Tregs é apresentado para em indivíduos de risco (n = 4). A diferença na capacidade de Tregs para suprimir CD25 versus CD25low células T responder foi significativa (teste t pareado p = 0,04).

Tabela 1. Esquemática criação de ensaio in vitro em supressão

	03/01	06/04	09/07	12/10
A	CD4CD25-	CD4CD25low	somente mídia	somente mídia
B	CD4CD25 / Tregs	CD4CD25low / Tregs	Tregs apenas	APC só
C
D
E
F
G
H

Discussão

Como a única característica única de Tregs, função supressiva deverá ser testado de forma confiável e de maneira uniforme entre os indivíduos em diferentes fases de desenvolvimento da doença dentro da mesma e entre diferentes estudos. Oferecemos os detalhes do ensaio de supressão desenvolvido em nosso laboratório como a nossa contribuição para a padronização deste ensaio. Em nosso estudo otimização, nós determinamos que a estimulação de células T com anti-CD3 humano revestido contas (UCHT1 clone, na concentração de 1μg/...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Nome do reagente ou instrumento	Companhia	Número de catálogo	Comentários (opcional)
Ficoll-Paque PLUS	Amersham Pharmacia Biotech	17-1440-03
DPBS-1X	Gibco	14190-144
Trypan Blue	Invitrogen	15250-061
anti-CD4 microesferas	Miltenyi	130-045-101
Pré-separação filtros	Miltenyi	130-041-407
Coluna LS	Miltenyi	130-042-401
EDTA	Invitrogen	15575-020
BSA	Sigma-Aldrich	B4287
Anti-humano CD4-APCCy7 (clone RPA-T4)	BD PharMingen	557852
Anti-humano CD25-PE (clone M-A251; IL-2Rα)	BD PharMingen	555432
Anti-humano CD8-FITC (clone RPA-T8)	BD PharMingen	555366
Anti-humano CD14-FITC (clone M5E2; receptor LPS)	BD PharMingen	555397
Anti-humano CD32-FITC (clone FLI8.26; FcγR do tipo II)	BD PharMingen	555448
Anti-humano CD116-FITC (clone M5D12; GM-CSFRα cadeia)	BD PharMingen	554532
Dynalbeads M-450 tosylactivated	Invitrogen	140-13
Anti-CD3 humano	Ancell	144-024
Buffer1	Caseiro		0,1 M Na 2 B 4 O 7 pH7.6
Buffer2	Caseiro		PBS/2mM BSA EDTA / 0,1% pH7.4
Buffer3	Caseiro		0.2M Tris/0.1% BSA pH8.5
RPMI completo media	Caseiro		RPMI 1640 media 2 mM L-glutamina 5 mM HEPES 100 U / mg / ml peni / strept 0,5 mM piruvato de sódio
[3 H] timidina	Perkin Elmer	NET027Z005MC
humanos agrupados soro AB	Atlanta Biologicals	S40110
Placa de colheita Multiscreen	Millipore	MAHFC1H60
Microscint 20	Perkin Elmer	6013621