Criando Two-Dimensional Substratos modelado para Confinamento de proteína e celular

Summary

Monocamadas auto-organizadas (SAMs) formado a partir de tióis de cadeia longa alcano em ouro proporcionar bem-definida substratos para a formação de padrões de proteínas e confinamento celular. Microcontact impressão de hexadecanethiol usando um carimbo de polidimetilsiloxano (PDMS), seguido pelo preenchimento com um glicol terminada alcano tiol monômero produz um padrão onde proteínas e células absorvem apenas para a região carimbada hexadecanethiol.

Abstract

Impressão microcontact fornece um método rápido e altamente reprodutível para a criação de substratos bem definidos padronizada. Microcontact ¹ Durante a impressão pode ser empregada para imprimir diretamente um grande número de moléculas, incluindo proteínas, DNA ^{2, 3} e silanos, ⁴ a formação de auto- monocamadas (SAMs) de tióis de cadeia longa alcano em ouro fornece uma maneira simples para confinar proteínas e células para padrões específicos contendo regiões adesivo e resistente. Esse confinamento pode ser usado para controlar a morfologia das células e é útil para examinar uma variedade de questões em proteínas e biologia celular. Aqui, descrevemos um método geral para a criação de padrões bem definidos de proteínas para estudos celulares ⁵ Esse processo envolve três etapas:. Produção de um mestre modelado usando fotolitografia, a criação de um selo de PDMS, e microcontact impressão de um ouro substrato revestido. Uma vez modelada, estes substratos de cultura de células são capazes de proteínas confinar e / ou células (pilhas ou linhas de células) para o padrão.

O uso de auto-montagem química monocamada permite o controle preciso sobre o padrão regiões proteína / células adesivas e não adesivas regiões, o que não pode ser conseguido usando stamping proteína direta. Hexadecanethiol, a longa cadeia de tiol alcano utilizado na etapa de impressão microcontact, produz uma superfície hidrofóbica que prontamente adsorve proteína de solução. O glicol terminada tiol, utilizado para preenchimento das regiões não-impressos do substrato, cria uma monocamada que é resistente a adsorção de proteínas e, portanto, de crescimento celular. ⁶ Estes monômeros tiol produzir monocamadas altamente estruturado que definir com precisão as regiões do substrato que pode suportar adsorção de proteínas eo crescimento celular. Como resultado, estes substratos são úteis para uma ampla variedade de aplicações, desde o estudo do comportamento intercelular ⁷ para a criação de microeletrônica. ⁸

Enquanto outros tipos de química monocamada têm sido utilizados para estudos de cultura de células, incluindo o trabalho do nosso grupo usando trichlorosilanes para criar padrões diretamente sobre substratos de vidro, ⁹ monocamadas padrão formado a partir de tióis alcano em ouro são straight-forward para se preparar. Além disso, os monômeros usados ​​para a preparação monocamada estão disponíveis comercialmente, estável, e não necessitam de armazenamento ou manipulação sob atmosfera inerte. Substratos padronizados preparados a partir de tióis alcano também pode ser reciclado e reutilizado várias vezes, mantendo confinamento na cela ^10.

Protocol

1. Preparação do Mestre modelado (Figura 1)

1. Centro de wafer de silício sobre o spin-aplicador e lave o wafer com acetona durante a etapa inicial do programa de rotação de dois ciclos na Tabela 1. A acetona evapora durante a segunda etapa do programa de spin deixando um wafer, limpo e seco.
2. Aplicar cerca de 1 mL fotorresiste AZ9245 / in (em diâmetro) para a bolacha e spin-coat usando as condições descritas na Tabela 1.
3. Soft-cozer a bolacha fotorresiste revestido a 110 ° C por 2 m usando uma placa de alta uniformidade.
4. Photopattern o substrato utilizando um sistema de fotolitografia direto escrever ou um sistema de alinhador de ....

Discussion

Uma série de questões podem surgir na produção litográfica do mestre utilizado para PDMS criação de selo. Subexposição dos resultados resistir revestido wafer nos padrões nebulosas e indistintas e superexposição dos resultados resistir revestido wafer em recursos alargada ou faltando. Em geral, os mestres com tamanhos recurso de grande porte (> 10 mm) são relativamente fáceis de desenvolver padrões e, ao mesmo tempo mestres com recursos menores podem exigir extensa otimização de parâmetros photopatterning e desenvolv.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome do reagente	Companhia	Número de catálogo	Comentários (opcional)
Pastilha de silício	Wafer Reclaim Serviços		2 polegadas
Spin-coater / prato quente	Brewer Ciência	Cee 200CB Spin-Bake Sistema
AZ9245 Photoresist	Mays Chemical Company	105880034-1160
Direto escrever sistema de fotolitografia	Microtech srl	LW325 Sistema LaserWriter
Alinhador de máscara	HTG	3h
AZ Desenvolvedor 400K	Mays Chemical Company	105880018-1160
Sylgard Kit de elastômero de silicone 182	Dow Corning
25 milímetros no. 1 rodada lamínulas de vidro	VWR	16004-310
Oxidizer Plasma	Diener	Femto
Titânio peças Kamis	Incorporado		99,95% puro
Pellets de ouro	Kamis Incorporated		99,999% puro
Feixe de elétrons do evaporador	Kurt J. Lesker	75 sistema de deposição PVD Thin Film	com feixe de elétrons acessório
Hexadecanethiol	Alfa Aesar	A11362
1-mercaptoundec-11-il) tetra (etilenoglicol)	Sigma Aldrich	674508
Etanol	Pharmco-aaper	111000200	200 prova, absoluta
Parafilm	VWR	52858-000
DPBS	VWR	4500-434	Sem cálcio e magnésio
Rato laminina I	VWR	95036-762
A fibronectina de plasma humano	Invitrogen	33016-015
AlexaFluor ® 647 ácido carboxílico, éster succinimidyl	Invitrogen	A-20006
MitoTracker Red 580	Invitrogen	M22425
AlexaFluor ® 350 ácido carboxílico, éster succinimidyl	Invitrogen	A-10168
Anticorpo anti-laminina	Fisher Scientific	AB2034MI