Fotólise de compostos enjaulado permite a produção de aumentos rápidos e localizados na concentração de vários compostos fisiologicamente ativos. Aqui, nós mostramos como obter patch-clamp gravações combinado com fotólise de cAMP gaiola ou enjaulado Ca para o estudo da transdução olfativos em dissociada do mouse neurônios sensoriais olfativos.
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Artigo de método
Flash Fotólise de Compostos Caged no Cilia de Olfactory neurônios sensoriais
Neste artigo
Resumo
Resumo
Fotólise de compostos enjaulado permite a produção de aumentos rápidos e localizados na concentração de vários compostos fisiologicamente ativos 1. Caged compostos são moléculas feitas fisiologicamente inativo por uma gaiola química que pode ser quebrado por um flash de luz ultravioleta. Aqui, nós mostramos como obter patch-clamp gravações combinado com fotólise de compostos enjaulado para o estudo da transdução olfativos em dissociada do mouse neurônios sensoriais olfativos. O processo de transdução olfativos (Figura 1) ocorre nos cílios dos neurônios sensoriais olfativos, onde odorant ligação aos receptores leva ao aumento de cAMP que abre nucleotídeo cíclico-gated (CNG) canais 2. Ca entrada através de canais CNG ativa os canais de Ca-activated Cl. Mostramos como dissociar os neurônios do epitélio olfativo do mouse 3 e como ativar canais CNG ou canais de Ca-Cl ativado por fotólise de cAMP enjaulado enjaulados Ca 4 ou 5 </ Sup>. Nós usamos uma lâmpada de flash 6,7 aplicar flashes ultravioleta à região ciliar para libertar da gaiola ou cAMP Ca enquanto patch-clamp gravações são tomadas para medir a corrente em toda a configuração de tensão de células-clamp 11/08.
Protocolo
1. Instrumentação
- Para medir a resposta de neurônios sensoriais olfativos à fotólise de compostos presos por gaiola, utilizamos uma lâmpada de flash em combinação com um sistema típico de gravação por patch-clamp, incluindo: um amplificador de patch-clamp, um eletrodo de gravação e um eletrodo de referência conectados à cabeça do amplificador de patch-clamp, um digitalizador, um computador, software para aquisição de dados, micromanipuladores, um microscópio de epifluorescência, um sistema de perfusão, uma mesa antivibração e uma gaiola de Faraday (Figura 2).
- Para gerar um flash de luz ultravioleta (UV) de alta intensidade, utilizamos uma lâmpada de flash de xenônio (Unidade de Flash JML-C2 da Rapp OptoElectronic, Figura 3A) que funciona descarregando um capacitor de alta tensão através de um tubo de flash de arco curto preenchido com gás xenônio6-7. O flash de luz pode ser acionado manualmente ou pelo computador, utilizando o mesmo software que controla a aquisição eletrofisiológica.
- Um filtro passa-baixo UV otimizado para aplicações de liberação por luz (270-390 nm) é inserido em um compartimento de saída da lâmpada de flash e uma guia de luz de fibra óptica de quartzo é conectada ao microscópio (ver 1.5).
- A intensidade do flash de luz e, portanto, a extensão da fotólise pode ser modificada alterando-se parâmetros específicos:
tensão ou capacitância6. De fato, a intensidade da luz está relacionada à energia armazenada no capacitor e depende do valor da capacitância e da tensão sobre ela, de acordo com a relação padrão 0.5 CV2. Um dentre três valores de capacitância pode ser selecionado no painel frontal da nossa lâmpada de flash (C1=1000 μF, C2=2000 μF ou C3=3000 μF) e a tensão pode variar entre 100 e 385 volts (Figura 3A), produzindo uma energia armazenada entre 5 e 220 J. A duração do flash varia de 0,5 a 1 ms na largura máxima total e depende do valor de capacitância selecionado. Antes de selecionar uma capacitância diferente ou ajustar a tensão para um valor mais baixo, é necessário descarregar o capacitor, selecionando o modo de descarga no painel frontal da lâmpada de flash (Figura 3A).
Contudo, a energia luminosa não é simplesmente proporcional à energia armazenada, por múltiplas razões relacionadas à física das descargas gasosas e às perdas não lineares no circuito à medida que a energia elétrica aumenta6. Para medir a energia associada a um flash de luz, pode-se utilizar um joulemetro, como o JM10 fornecido pela RappOptoElectronics. Observe que a energia na saída da guia de luz de quartzo com filtro UV instalado está na faixa de 1-15 mJ por flash, conforme relatado no manual do usuário da Unidade de Flash da Rapp OptoElectronic.
Um conjunto de fotodiodo (Figura 3B) é fornecido com a unidade de lâmpada de flash e pode ser usado para estimar variações na intensidade da luz em função de C e V. De fato, a saída do fotodiodo é proporcional à intensidade da luz. Seguindo as instruções do manual, a guia de luz é conectada à entrada do conjunto de fotodiodo, enquanto a saída é conectada a um osciloscópio. A Figura 3C mostra a tensão de pico de saída do fotodiodo em resposta aos flashes de luz para os três valores de capacitância C1, C2 ou C3 disponíveis na nossa unidade de lâmpada de flash, em função da tensão aplicada. Esses valores mudarão à medida que a lâmpada de flash envelhecer. É uma boa prática usar regularmente o fotodiodo para verificar a deterioração da lâmpada de flash.
Em vez de modificar a capacitância e/ou a tensão no painel frontal, um controle mais preciso e rápido da intensidade da luz é obtido colocando filtros de densidade neutra em um segundo compartimento de filtro da lâmpada de flash (Figura 3A). Essa abordagem é mais rápida e, adicionalmente, a duração do flash, que depende do valor de capacitância selecionado, não é modificada. Com filtros de densidade neutra variando de 100% a 0,1% de transmissão, a intensidade do flash pode ser rapidamente modificada em uma ampla faixa. - O flash de luz é direcionado ao neurônio, cultivado em placas com fundo de vidro, por meio de uma guia de luz de fibra óptica de quartzo (Figura 2). A guia de luz é conectada ao acoplamento de epifluorescência do microscópio invertido usando um adaptador. Um cubo de filtro modificado, sem filtro de excitação, direciona o feixe UV ao neurônio por meio de um espelho dicromático.
- A luz é focalizada através de uma objetiva de imersão em óleo de 100x. A área coberta pelo flash é visualizada inserindo-se a guia de luz em um iluminador que fornece uma fonte contínua de luz visível. A imagem (representada em amarelo no vídeo) é visualizada em um monitor por meio de uma câmera CCD conectada ao microscópio. O contorno da área iluminada é desenhado no monitor para localizar a área do flash UV para os experimentos. Antes de aplicar o flash UV, a região ciliar do neurônio é posicionada na área desenhada no monitor.
- A dimensão do ponto de luz UV é controlada pelo aumento da objetiva, pelo diâmetro da guia de luz e pela posição da guia de luz na parte traseira do microscópio. Utilizamos uma objetiva de imersão em óleo com aumento de 100x. O diâmetro do ponto circular é medido direcionando a luz de um iluminador a uma lâmina micrométrica colocada na platina do microscópio. O diâmetro do ponto em nossa configuração é aproximadamente 16, 33, 50 ou 105 μm para uma guia de luz com diâmetro respectivamente de 200, 400, 600 ou 1250 μm.
2. Preparação de soluções
Dissecação
- Solução de Ringer: 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 10 mM HEPES, 10 mM glicose, 1 mM piruvato de sódio (pH 7,4 ajustado com NaOH 1 M).
- Solução de parada: solução de Ringer com BSA 0,1 mg/ml, leupeptina 0,3 mg/ml e DNaseI 0,02 mg/ml.
- Solução de Ringer sem divalentes: 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 10 mM HEPES, 1 mM EDTA, 10 mM glicose, 1 mM piruvato de sódio (pH 7,4 com NaOH 1 M). Adicione 200 μM cisteína e 2 U/ml de papaína para dissociação enzimática.
Observação: Filtrar esterilmente as soluções para dissecção.
Soluções para gravação com eletrodo de patch
Soluções extracelulares
- Solução extracelular de Ringer: 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 10 mM HEPES, 10 mM glicose, 1 mM piruvato de sódio (pH 7,4 ajustado com NaOH 1 M).
- Solução de Ringer com baixo teor de Ca: 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 10 mM EGTA, 1 mM MgCl2, 10 mM HEPES, 10 mM glicose, 1 mM piruvato de sódio (pH 7,4 ajustado com NaOH 1 M).
Soluções intracelulares
Prepare e utilize sempre soluções de compostos fotoligáveis em luz fraca para evitar a degradação dos compostos causada pela luz ambiente. Proteja os recipientes da luz usando folha de alumínio.
cAMP fotoativável:
- Prepare uma solução intracelular contendo 145 mM KCl, 4 mM MgCl2, 0,5 mM EGTA, 10 mM HEPES, 1 mM MgATP e 0,1 mM NaGTP (pH 7,4 ajustado com KOH 1 M).
- Prepare uma solução estoque dissolvendo cAMP preso (BCMCM-cAMP4) em DMSO a 50 mM. Faça alíquotas de 5 μl. Armazene por até um ano a -20°C.
- Dissolva uma alíquota da solução estoque de cAMP preso na solução intracelular para obter uma concentração final de 50 μM de cAMP preso. Misture utilizando um vórtex.
- Prepare alíquotas de 1 ml da solução intracelular com cAMP preso. Armazene por até dois meses a -20°C até o uso.
Ca aprisionado:
Preparamos soluções intracelulares contendo DMNP-EDTA 3 mM5 carregado em 50% com Ca 1,5 mM.
- Prepare uma solução intracelular contendo 140 mM KCl (ou CsCl), 10 mM HEPES (pH 7,4 ajustado com KOH 1 M ou CsOH).
- Abra um frasco de 5 mg de DMNP-EDTA. Adicione 52,8 μl de uma solução padrão de cloreto de cálcio 0,1 M e 1 ml da solução intracelular. Misture utilizando um vórtex.
- Para evitar a liberação do Ca preso pela luz ambiente, transfira a solução para um tubo protegido da luz com papel alumínio. Adicione solução intracelular até atingir um volume final de 3,5 ml. Misture utilizando um vórtex. Faça alíquotas de aproximadamente 1 ml da solução intracelular com Ca preso e armazene por até dois meses a -20°C até o uso.
Observações: Durante os experimentos, proteja as soluções do composto fotoativável da luz usando folha de alumínio e mantenha-as sobre gelo. Filtre esterilmente a solução intracelular.
3. Dissociação de neurônios sensoriais olfativos de camundongo
Os animais foram manipulados de acordo com as Diretrizes Italianas para o Uso de Animais de Laboratório (Decreto Legislativo 27/01/1992, n.º 116) e as diretrizes da União Europeia sobre pesquisa com animais (n.º 86/609/CEE).
- Prepare três placas de vidro com fundo de vidro recobertas com concanavalina-A a 10 mg/ml e poli-L-lisina a 10 mg/ml.
- Para preparar a dissecação, prepare 1 ml de solução de Ringer sem divalentes. Encha duas placas de Petri de 50 mm recobertas com Sylgard com solução de Ringer e coloque-as sobre gelo. Resfrie também uma mistura de papaina-cisteína, 0,5 ml da solução de parada e uma seringa com filtro de 0,22 μm contendo cerca de 10 ml de solução de Ringer.
- Sacrifique um camundongo por asfixia com CO2, seguida de decapitação. Remova a pele sobreposta ao crânio, corte ao longo das linhas da mandíbula e coloque a cabeça em uma placa de Petri recoberta com Sylgard.
- Coloque a placa sob um estereomicroscópio. Usando um bisturi, biseccione a cabeça sagitalmente ao longo da linha média. Vire metade da cabeça com o lado medial voltado para cima. Remova cuidadosamente o septo para expor os cornetos (ver também Cygnar et al., 201013).
- Usando pinças nº 3 e um bisturi, remova os cornetos revestidos com epitélio olfatório. Transfira para uma placa de Petri recoberta com Sylgard.
- Usando pinças finas nº 55, separe os fragmentos de epitélio olfatório das partes anexadas dos cornetos. Transfira-os para um tubo contendo 1 ml de solução de Ringer sem divalentes. Adicione a mistura de papaina e cisteína. Com microtesouras, pique os epitélios e incube à temperatura ambiente por 3 minutos. Pique novamente suavemente com microtesouras e aguarde mais 5 minutos.
- Usando uma pipeta de Pasteur flamejada, transfira para um tubo contendo 0,5 ml da solução de parada.
- Centrifugue a 300 g (1500 RPM) durante 5 minutos. Descarte o sobrenadante e adicione cerca de 1 ml de solução de Ringer filtrada. Triture suavemente com uma pipeta de Pasteur flamejada.
- Plaque cerca de 0,3 ml da solução contendo as células no centro das três placas de vidro com fundo de vidro. Deixe as células sedimentarem por cerca de uma hora a +4°C. Adicione solução de Ringer.
4. Gravação
- Prepare pipetas de patch a partir de capilares de borossilicato para obter resistências de 3-7 MΩ quando preenchidas com solução intracelular.
- Coloque um recipiente de vidro com fundo de vidro contendo os neurônios sensoriais olfativos dissociados sobre a platina do microscópio invertido. Perfunda com solução de Ringer.
- Proteja uma seringa contendo a solução intracelular com compostos fotoencapsulados da luz com papel alumínio e mantenha-a refrigerada. Trabalhe com pouca luz para evitar a degradação dos compostos fotoencapsulados pela luz ambiente.
- Procure um neurônio sensorial olfativo isolado com cílios intactos em uma ampliação de 100x. Mova a platina do microscópio para posicionar a região ciliar dentro do círculo desenhado no monitor, a fim de localizar a área previamente identificada para o flash de UV.
- Encha uma pipeta de patch com a solução intracelular contendo o composto fotoencapsulado utilizando uma agulha flexível. Remova bolhas da ponta da pipeta. Insira a pipeta no suporte na cabeça do amplificador de patch-clamp. Aproxime-se do corpo celular do neurônio usando o micromanipulador e aplique sucção suave para obter um selo de gigaohm. Ajuste a voltagem em -60 mV e aplique sucção adicional para alcançar o modo de célula inteira utilizando técnicas padrão de patch-clamp12.
- Aguarde pelo menos dois minutos para a difusão do composto fotoencapsulado até os cílios.
- No computador, inicie um protocolo de estimulação e registre a resposta. Utilize um filtro passa-baixa em 1 kHz e digitalize com uma frequência de amostragem de pelo menos 2 kHz.
- Um protocolo de estimulação típico mantém a voltagem em um valor constante e dispara a liberação de um flash de UV da lâmpada de flash para a fotólise do composto fotoencapsulado na região ciliar.
5. Resultados representativos:
Você deve ser capaz de produzir a liberação local de cAMP ou de Ca aprisionados na região ciliar de um neurônio sensorial olfativo isolado e registrar a resposta de corrente na configuração de fixação de voltagem em célula inteira.
A Figura 4 mostra uma corrente interna típica provocada por um flash de UV que produz a fotólise do cAMP preso, registrada a uma voltagem de -60 mV na presença de uma solução de Ringer com baixo teor extracelular de Ca. Nessas condições, a corrente interna é devida à entrada de Na através de canais CNG. A fase ascendente da corrente foi rápida e foi ajustada por uma função exponencial simples com uma constante de tempo de 3,4 ms.
As Figuras 5A-B mostram as respostas de outro neurônio sensorial olfativo em solução com baixo teor de Ca e em solução de Ringer com 1 mM de Ca. A fase ascendente da corrente em -60 mV tornou-se muito mais lenta e multifásica (Figuras 5 A-B). Isso ocorre devido à ação do Ca que entra nos cílios através dos canais CNG e ativa uma corrente secundária de Cl10. O componente catiônico anterior da corrente, decorrente da ativação dos canais CNG, é menor na solução de Ringer com 1 mM de Ca do que na solução com baixo teor de Ca, devido ao bloqueio causado pelos íons Ca que permeiam e reduzem a corrente total.
Outra maneira de reduzir o aumento de Ca nas cílios é fixar o neurônio em +60 mV (Figura 5 C-D). A fase ascendente da resposta devido à liberação de cAMP em +60 mV foi bem descrita por uma exponencial simples com uma constante de tempo de 6,7 ms, indicando a presença de apenas um componente de corrente.
Ao liberar Ca por fotoativação no interior dos cílios de um neurônio sensorial olfatório, você deverá ser capaz de medir uma corrente que aumenta rapidamente. Essa corrente é conduzida por íons Cl⁻. A Figura 6 A mostra correntes entrantes em -50 mV induzidas pela liberação fotoativa de Ca aprisionado em resposta a flashes de UV de diferentes intensidades. A fase ascendente das correntes de Cl⁻ ativadas por Ca foi bem descrita por uma exponencial simples, com constantes de tempo variando entre 3,8 e 5 ms (Figura 6 B).
Figura 1. Transdução olfativa nas cílios dos neurônios sensoriais olfativos. Moléculas odorantes ligam-se a receptores de odorantes (OR), ativando uma proteína G que, por sua vez, ativa a adenilil ciclase (ACIII), produzindo um aumento intracelular de cAMP. O cAMP abre canais ativados por nucleotídeos cíclicos (CNG), permitindo a entrada de íons Na e Ca. O aumento do Ca intracelular ativa canais de Cl ativados por Ca. cAMP preso ou Ca preso podem ser introduzidos nos cílios por difusão através de uma pipeta de patch. Um flash de luz UV produz a fotólise do composto preso (Modificado, com permissão, de Pifferi et al. 20062).
Figura 2. O sistema de gravação por patch-clamp e fotólise com flash. Os componentes da montagem incluem um amplificador de patch-clamp, um computador, um digitalizador, um microscópio de epifluorescência, uma lâmpada de flash de xenônio, uma câmera CCD e um monitor. Linhas azuis e violeta indicam, respectivamente, os trajetos da luz visível e da luz UV.
Figura 3. Lâmpada de flash de xenônio. (A) Fonte de luz utilizada para a fotólise por flash de compostos encapsulados. (B) Módulo de fotodiodo utilizado para avaliar a intensidade do pulso luminoso. (C) A guia de luz da lâmpada de flash foi conectada à entrada do fotodiodo e a saída foi visualizada em um osciloscópio. Um dos três valores de capacitância disponíveis (C1, C2 ou C3) foi selecionado no interruptor do painel frontal da lâmpada de flash e a tensão foi ajustada girando o botão no painel frontal. A tensão de saída do fotodiodo em resposta a diferentes intensidades de flash foi representada graficamente em função da tensão aplicada para cada valor de capacitância: C1 = 1000 μF, C2 = 2000 μF ou C3 = 3000 μF. Utilizou-se uma guia de luz com diâmetro de 600 μm.
Figura 4. Gravação por patch-clamp em resposta à fotólise de cAMP preso em solução extracelular com baixo teor de Ca. (A) Resposta da corrente em célula inteira induzida em um neurônio sensorial olfativo isolado pela fotólise de cAMP preso, localizado nos cílios. Um flash de luz UV foi aplicado no momento indicado pela seta. O potencial de retenção foi de -60 mV. (B) A fase ascendente da corrente foi bem ajustada com uma função exponencial simples (linha tracejada), com constante de tempo de 3,4 ms.
Figura 5. Respostas de corrente induzidas pela fotólise de cAMP preso em baixo Ca e em soluções de Ringer. (A) Um neurônio sensorial olfativo foi banhado em solução de Ringer contendo 1 mM de Ca ou em solução com baixo teor de Ca, no potencial de retenção de -60 mV. Um flash de luz ultravioleta foi liberado no momento indicado pela seta. (B) As respostas de corrente representadas em uma escala de tempo expandida mostraram uma fase ascendente multifásica em Ringer, enquanto a fase ascendente foi bem ajustada com uma função exponencial simples (linha tracejada), com uma constante de tempo de 3,5 ms para a resposta registrada na solução com baixo teor de Ca. (C) Respostas de corrente do mesmo neurônio mostrado em (A), banhado em solução de Ringer, nos potenciais de retenção de -60 mV e +60 mV. (D) As respostas de corrente representadas em uma escala de tempo expandida exibiram uma fase ascendente multifásica em -60 mV, enquanto em +60 mV a fase ascendente foi bem ajustada por uma exponencial simples com constante de tempo de 6,7 ms (linha tracejada).
Figura 6. Respostas à fotólise do Ca preso em gaiola. (A) Correntes em célula inteira induzidas pela fotólise do Ca preso em gaiola a -50 mV. Pulsos de luz UV foram aplicados no momento indicado pela seta. As intensidades dos pulsos foram variadas com filtros de densidade neutra. (B) Escala de tempo expandida mostra o aumento rápido da corrente após a liberação fotoinduzida de Ca. As correntes foram bem ajustadas por uma função exponencial simples (linhas tracejadas), com constantes de tempo de 5, 4,8, 3,8 ms. (Reproduzido, com permissão, de Boccaccio & Menini, 200710).
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Discussão
Flash fotólise de compostos enjaulado combinado com patch-clamp gravações é uma técnica útil para obter saltos rápidos e local da concentração de moléculas ativas fisiologicamente dentro e fora das células. Vários tipos de compounds1 enjaulado foram sintetizados, e esta técnica pode ser aplicada a vários tipos de células, incluindo células cultivadas expressar canais iônicos que podem ser ativadas ou moduladas por fotólise de alguns dos compostos disponíveis enjaulado 11.
Fotólise...
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Divulgações
Não há conflitos de interesse declarados.
Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Equipamento | Companhia | Número de catálogo | Comentários |
| Adaptador módulo da lâmpada de flash para microscópio | Rapp optoeletrônicos | FlashCube 70 | |
| Air tabela | TMC | MICRO-g 63-534 | |
| Digitizer | Axon Instruments | Digidata 1322A | |
| Aquisição de Dados Software | Axon Instruments | pClamp 8 | |
| Software Análise de dados | WaveMetrics | Igor | |
| Espelho para módulo adaptador | Rapp optoeletrônicos | M70/100 | |
| Suporte do eletrodo | Axon Instruments | 1-HL-U | |
| Gaiola de Faraday | Feitos | ||
| Cubo de filtro | Olimpo | U-UTH | Filtro de excitação removido |
| Lâmpada de flash | Rapp optoeletrônicos | JML-C2 | |
| Fórceps Dumont # 55 | Precision Instruments mundo | 14099 | |
| Capilares de vidro | Precision Instruments mundo | PG10165-4 | |
| Prato fundo de vidro | Precision Instruments mundo | FD35-100 | |
| Iluminador | Olimpo | Destaque 3100 | |
| Microscópio invertido | Olimpo | IX70 | |
| Micromanipuladores | Luigs & Neumann | SM eu | |
| Micropipeta Puller | Narishige | PP-830 | |
| Monitor | HesaVision | MTB-01 | |
| Os filtros de densidade neutra | Omega Optical | varia | |
| Objetivo 100X | Zeiss | Fluar 440285 | Ou Zeiss ou Olympus |
| Objetivo 100X | Olimpo | UPLFLN 100XOI2 | Ou Zeiss ou Olympus |
| Ópticos UV shortpass filtro | Rapp optoeletrônicos | SP400 | |
| Amplificador de patch-clamp | Axon Instruments | Axopatch 200B | |
| Foto de díodo | Rapp optoeletrônicos | PDA | |
| Guia de luz de quartzo | Rapp optoeletrônicos | varia | Usamos 600 mM de diâmetro |
| Fio de prata | Precision Instruments mundo | AGT1025 | |
| Prata chão pellet | Warner instrumentos | 64-1309 | |
| Xenon arco da lâmpada | Rapp optoeletrônicos | XBL-JML |
| Reagente | Companhia | Número de catálogo |
|---|---|---|
| BCMCM gaiolas cAMP | Biolog | B016 |
| Albumina de soro bovino (BSA) | Sigma | A8806 |
| CaCl2 solução padrão 0,1 M | Fluka | 21059 |
| Ca Caged: DMNP-EDTA | Invitrogen | D6814 |
| Cisteína | Sigma | C9768 |
| Concanavalina A V tipo (ConA) | Sigma | C7275 |
| CsCl | Sigma | C4036 |
| DMSO | Sigma | D8418 |
| DNAse I | Sigma | D4527 |
| EDTA | Sigma | E9884 |
| EGTA | Sigma | E4378 |
| Glicose | Sigma | G5767 |
| HEPES | Sigma | H3375 |
| KCl | Sigma | P3911 |
| KOH | Sigma | P1767 |
| Leupeptin | Sigma | L0649 |
| MgCl2 | Fluka | 63020 |
| Papaína | Sigma | P3125 |
| Poli-L-lisina | Sigma | P1274 |
| NaCl | Sigma | S9888 |
| NaOH | Sigma | S5881 |
| NaPyruvate | Sigma | P2256 |
Referências
- Ellis-Davies, G. C. R. Caged compounds: photorelease technology for control of cellular chemistry and physiology. Nat. Methods. 4, 619-628 (2007).
- Pifferi, S., Boccaccio, A., Menini, A. Cyclic nucleotide-gated ion channels in sensory transduction. FEBS Lett. 580, 2853-2859 (2006).
- Bozza, T. C., Kauer, J. S. Odorant response properties of convergent olfactory receptor neurons. J. Neurosci. 18, 4560-4569 (1998).
- Hagen, V., Bendig, J., Frings, S., Eckardt, T., Helm, S., Reuter, D. Highly Efficient and Ultrafast Phototriggers for cAMP and cGMP by Using Long-Wavelength UV/Vis-Activation. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 40, 1045-1048 (2001).
- Kaplan, J. H., Ellis-Davies, G. C. Photolabile chelators for the rapid photorelease of divalent cations. Proc. Natl. Acad. Sci. 85, 6571-6575 (1988).
- Rapp, G. Flash lamp-based irradiation of caged compounds. Methods. Enzymol. 291, 202-222 (1998).
- Gurney, A. M. Flash photolysis of caged compounds. Microelectrodes: Theory and Applications. Montenegro, I., Queiros, M. A., Daschbach, J. L. , Proc. NATO Adv. Study Inst. Portugal. (1991).
- Lagostena, L., Menini, A. Whole-cell recordings and photolysis of caged compounds in olfactory sensory neurons isolated from the mouse. Chem. Senses. 28, 705-716 (2003).
- Boccaccio, A., Lagostena, L., Hagen, V., Menini, A. Fast adaptation in mouse olfactory sensory neurons does not require the activity of phosphodiesterase. J. Gen. Physiol. 128, 171-184 (2006).
- Boccaccio, A., Menini, A. Temporal development of cyclic nucleotide-gated and Ca2+ -activated Cl- currents in isolated mouse olfactory sensory neurons. J. Neurophysiol. 98, 153-160 (2007).
- Sagheddu, C., Boccaccio, A., Dibattista, M., Montani, G., Tirindelli, R., Menini, A. Calcium concentration jumps reveal dynamic ion selectivity of calcium-activated chloride currents in mouse olfactory sensory neurons and TMEM16B-transfected HEK 293T cells. J. Physiol. 588, 4189-4204 (2010).
- Balana, B., Taylor, N., Slesinger, P. A. Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (44), e2189-e2189 (2010).
- Cygnar, K. D., Stephan, A. B., Zhao, H. Analyzing Responses of Mouse Olfactory Sensory Neurons Using the Air-phase Electroolfactogram Recording. J. Vis. Exp. (37), e1850-e1850 (2010).
- Bernardinelli, Y., Haeberli, C., Chatton, J. Y. Flash photolysis using a light emitting diode: an efficient, compact, and affordable solution. Cell. Calcium. 37, 565-572 (2005).
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Reimpressões e permissões
