Previsão do HIV-1 de uso co-receptor (tropismo) por análise de seqüência usando uma abordagem genotípica

Summary

A predição do uso de co-receptor de HIV-1 é necessário para a administração de uma nova classe de fármacos anti-retrovirais co-receptor, ou seja, os antagonistas. Ela pode ser realizada por análise da sequência do Env Gene e posterior interpretação através de um sistema de interpretação baseado na Internet (geno2pheno _[Coreceptor]).

Abstract

Maraviroc (MVC) é o fármaco anti-retroviral licenciada primeiro da classe dos antagonistas do co-receptor. Ele liga-se ao hospedeiro co-receptor CCR5, que é utilizado pela maioria das estirpes de HIV para infectar células humanas imunes (Fig. 1). Outros isolados de HIV usar um co-receptor diferente, o CXCR4. Receptor que é utilizado, é determinada no vírus pela proteína Env (Fig. 2). Dependendo do co-receptor utilizado, os vírus são classificados como R5 ou X4, respectivamente. MVC se liga ao receptor CCR5 inibir a entrada de vírus R5 na célula-alvo. Durante o curso da doença, os vírus X4 pode emergir e superar os vírus R5. Determinação do co-receptor usage (também chamado tropismo) é, portanto, obrigatório, antes da administração de MVC, como exigido pela FDA e EMA.

Os estudos para MVC eficiência MOTIVATE, mérito e 1029 foram realizados com o ensaio Trofile de monograma, San Francisco, EUA Este é um ensaio de alta qualidade baseado sophisticated testes recombinantes. A aceitação para este teste para a rotina diária é bastante baixo fora dos EUA, já que os médicos europeus e não tendem a trabalhar com laboratórios especializados descentralizadas, que também oferecem testes de resistência concomitante. Esses laboratórios foram submetidos a avaliações de qualidade de garantia de vários, o último a ser apresentado em 2011 ^1.

Há vários anos, temos realizado determinações tropismo com base em análise da seqüência da região HIV gene env-V3 (V3) ^2. Esta região contém informação suficiente para executar uma previsão fiável. A determinação genotípica de uso co-receptor apresenta vantagens como: menor tempo de volume de negócios (equivalente ao teste de resistência), custos mais baixos, possibilidade de adaptar os resultados para as necessidades dos pacientes e possibilidade de analisar amostras clínicas com muito baixo ou mesmo indetectáveis ​​de carga viral (CV ), particularmente desde que o número de amostras analisadas com VL <1000 cópias / mLaproximadamente aumentou nos últimos anos (Fig. 3).

Os passos principais para os testes de tropismo (Fig. 4) demonstrado neste vídeo:

1. Coleta de uma amostra de sangue
2. O isolamento do RNA do HIV no plasma e / ou de ADN proviral de VIH a partir de células mononucleares de sangue
3. A amplificação da região env
4. A amplificação da região V3
5. Reação seqüência do amplicon V3
6. A purificação das amostras de sequenciação
7. A sequenciação das amostras purificadas
8. Edição seqüência
9. Sequenciamento interpretação de dados e previsão tropismo

Protocol

O protocolo está resumida na fig. 4.

1. Coleta de amostras de sangue

1. Recolher, pelo menos, 3 ml de sangue em tubos de EDTA no local da clínica.
2. As amostras podem ser armazenadas até uma semana a 4 ° C.
3. Encaminhar as amostras de sangue EDTA-o mais rapidamente possível para o laboratório por correio normal.

2. O isolamento de RNA do HIV e / ou DNA

1. Obter o RNA viral e / ou de ADN a partir de 1000 uL de sangue total, soro ou plasma, utilizando-se o isolamento do ácido Magna Pure Compact Nucleic I kit I e do Sistema Pure Magna Compacto.
2. Eluir o RNA ou DNA obtido em 50 ul de tampão TE. Alternativamente, outros processos de ácidos nucleicos de purificação podem ser usados.

3. A amplificação da região env

Amplificação da região env (Figs. 2 e 4) a partir de plasma ou de ARN ou ADN proviral. Um produto de 1245 pb de comprimento, que compreende a maior parte da proteína Env (nt 6556-7811 according de HXB2) é gerado.

1. As amostras de RNA: RT-PCR da reacção
   1. RNA viral apresenta uma estrutura muito complexa secundária (Fig. 4) que podem impedir a reacção de RT. Para evitar este problema, incubar 10 ul de RNA a 65 ° C durante 10 minutos (já no tubo de PCR e na máquina de PCR) e em seguida reduzir a temperatura a 50 ° C.
   2. Adicionar 40 ul da PCR Master Mix incluindo os iniciadores Env-F e Env-R.
      
      Mix Master para RT-PCR In-House System:
      

      	volume / reacção (ul)	concentração final
      RNase H 2 O	14,4
      Tampão de 5x (Qiagen OneStep RT-PCR Kit)	10	1x
      5x solução de Q-	10	1x
      dNTP Mix (10 mM cada)	2	400 uM de cada dNTP
      Enzym-Mix (Qiagen OneStep RT-PCR Kit)	2
      Primer Env-F (100 uM)	0,3	0,6 uM
      Primer Env-R (100 uM)	0,3	0,6 uM
      Inibidor de RNase (RNasin)	1	5 unidades / reação

      
      
      Env-F: 5'-CAAAGCCTAAAGCCATGTGTAAA -3 '(nt 6556 → 6586 de acordo com HXB2)
      
      Env-R: 5'-AGTGCTTCCTGCTGCTCCTAAGAACCC -3 '(nt 7785 ← 7811)
   3. Executar a reacção de RT a 50 ° C durante 30 minutos.
   4. Executar a primeira PCR como se segue:
      
      

      95 ° C, 15 min	1 x
      95 ° C, 30 seg 50 ° C, 30 seg 72 ° C, 2 min
      95 ° C, 30 seg 56 ° C, 30 seg 72 ° C, 2 min	38 x
      72 ° C, 10 min 4 ° C ∞

      1 x
2. As amostras de DNA: reacção de PCR
   
   Para as amostras de ADN proviral, nenhuma reacção de RT inicial é necessária, e a reacção de PCR pode iniciar directamente.
   1. Adicionar 40 ul de PCR Master Mix para 10 ul de DNA provial.
      
      
      Mix Master para PCR In-House System:
      

      	volume / reacção (ul)	concentração final
      RNase H 2 O	15,4
      Tampão de 5x (HotStarTaq ADN Polimerase)	10	1x
      5x solução de Q-	10	1x
      dNTP Mix (10 mM cada)	2	400 uM de cada dNTP
      Enzym-Mix (HotStarTaq ADN Polimerase)	2
      Primer Env-F (100 uM)	0,3	0,6 uM
      Primer Env-R (100 uM)	0,3	0,6 uM

      
      
      Env-F: 5'-CAAAGCCTAAAGCCATGTGTAAA -3 '(nt 6556 → 6586)
      
      Env-R: 5'-AGTGCTTCCTGCTGCTCCTAAGAACCC -3 '(nt 7785 ← 7811)
   2. Executar as condições de PCR como descrito anteriormente para as amostras de ARN (Passo 3.1.4).

4. A amplificação da região V3: PCR aninhada

1. Para a PCR aninhada, usar 5 ul a partir da primeira reacção de PCR (sem análise anterior, em gel de agarose) como modelo e adicionar 95 ul de PCR MasMisture ter.
   
   Mix Master de Nested-PCR In-House

   	volume / reacção (ul)	concentração final
   H 2 O	61,9
   Tampão de PCR 10x	10	1x
   5x solução de Q-	20	1x
   dNTP Mix (10 mM cada)	2	200 uM de cada dNTP
   Primer Env-2F (100 uM)	0,3	0,6 uM
   Primer Env-2R (100 uM)	0,3	0,6 uM
   HotStarTaq ADN Polimerase	0,5	2,5 unidades / reacção

   
   
   Env-2F: 5'-GTCCAAAGGTATCCTTTGAGCCAATTC -3 '(nt 6838 → 6864)
   
   
2. Executar a PCR como se segue:

   93 ° C, 15 min	1 x
   95 ° C, 30 seg 50 ° C, 30 seg 72 ° C, 90 seg	1 x
   95 ° C, 30 seg 56 ° C, 30 seg 72 ° C, 90 seg	43 x
   72 ° C, 10 min 4 ° C ∞

3. Analisar o produto de PCR num gel de agarose a 1% (Fig. 4). O produto esperado é 902 bp de comprimento.
4. A purificação das amostras de sequenciação.
   1. Purifica-se o produto de PCR com o kit Qiagen PCR Purification, utilizando-se o protocolo, soluções e micro-colunas fornecidas pelo fornecedor. Eluir em 30-100 ul de tampão PE, dependendo da intensidade da banda.
   2. Alternativamente, as amostras podem ser purificados utilizando ExonucleaseI e Fast AP (Thermo fosfatase alcalina). Para este fim, adicionar 6 Mix Exo-AP a 15 uL do produto de PCR e incubar 15 minutos a 37 ° C.

      580 ul de H2O

      66 ul AP rápido

      13,4 Exo ul eu

5. Reação seqüência do amplicon V3

1. A reacção consiste em uma sequência de reacção de PCR, utilizando um dos seguintes iniciadores:
   
   Env-2: 5'-GTACAATGYACACATGGAATTAGGC -3 (nt 6959 → 6980)
   Env-5: 5 '-AAAATTCCCCTCCACAATTA - 3' (nt 7352 ← 7371)
   Env-6: 5'-GGCCAGTAGTATCAACTCAAC - 3 '(nt 6979 → 7000)
   Env-7: 5'-TGTCCACTGATGGGAGGGGC - 3 '(nt 7530 ← 7549)
   Env-10: 5 '- GCAGAATAAAACAAATTATAAACATGTGGC - 3' (nt 7478 ← 7507)
   Env-11: 5 '- TACATTGCTTTTCCTACTTTCTGCCAC - 3' (nt 7638 ← 7664)
   Iniciadores de primeira escolha são: Env-2, 6 ou Env-Env-7, Env-11
2. Use 1 ul do fragmento amplificado V3 purificado como modelo e adicionar 9 ul de PCR mestre de mistura.
   
   Sequenciamento Mix Master:

   4 ul mistura de sequência (HIV-Genotipagem Kit)

   4 ul de H2O

   Um Primer ul (100 pmol / pL)

3. Executar a sequência de reacção como se segue:

   96 ° C, 10 seg
   50 ° C, 10 seg	36 x
   60 ° C, 45 seg
   4 ° C ∞

6. A purificação das amostras de sequenciação

Purificar seqüências using Sephadex G-50 superfina.

1. Encher o número adequado de poços no "carregador coluna" com Sephadex G-50 superfina. Transfira o Sephadex ao MAHVN4510 placa de filtro virando.
2. Adicionar 300 ul de água Milli-Q H ₂ O a cada poço na placa de filtro, e incubar-lo durante pelo menos 3 horas a 2-8 ° C.
3. Centrifugar as placas durante 5 min a 910Xg e 4-15 ° C. Descartar o fluxo através.
4. Adicionar 10 ul de H ₂ O para o produto de sequência e, em seguida, a sequência da pipeta na placa de Sephadex incharam.
5. Para obter o produto purificado, centrifugar a placa durante 5 min. em 910Xg e 4-15 ° C e recolher o fluxo através.

7. A sequenciação das amostras purificadas no sequenciador ABI Prism 3130 XL

1. Antes de cada corrida, mudar o tampão e verificar o volume do polímero (POP7). Se necessário, substituir o polímero frasco velho por um novo.
2. Use as condições de execução salvas, incluindo um tempo de injeção de 18 segundos.
3. Nesta máquina, a recolha de dados de sinal de uma experiência com 16 amostras de sequências leva cerca de 60 minutos (36 cm capilar) ou 150 minutos (50 cm capilar).

8. Edição seqüência

1. Usar o programa Lasergene (DNA-Star) para alinhar e editar as sequências (Fig. 5). Outros programas de edição de sequências pode ser utilizado. Utilizar um "B-V3 Consenso" e a sequência de consenso env como referências.
2. Lasergene cria uma sequência de consenso da amostra analisada utilizando todos os dados em bruto disponíveis, e armazená-lo como um ficheiro FASTA. O ficheiro FASTA é um ficheiro de texto que inclui um cabeçalho com o nome da amostra e da sequência de nucleótidos.

9. Sequenciamento interpretação de dados e previsão tropismo

1. Sequenciação de interpretação dos dados é realizada pelo sistema de interpretação com base na web geno2pheno _[coreceptor] ( http://coreceptor.bioinf.mpi-inf.mpg.de/index.php). Para a predição tropismo, configurações de FPR diferentes podem ser seleccionados. A configuração padrão é de acordo com as diretrizes germano-austríaca de terapia. Para FPR ≥ 20%, o vírus é classificado como R5 quando FPR ≥ 20% e X4 para FPR <12,5%.
2. Carregar o arquivo FASTA no servidor. Este servidor traduz a sequência de nucleótidos em aminoácidos, alinha-o com a sequência de consenso V3-B e produz uma classificação de subtipo. Além disso, ele gera uma previsão da utilização co-receptor (Fig. 4), expresso como a taxa de falso positivo (FPR).

10. Resultados representativos

O geno2pheno _[coreceptor] saída mostra uma interpretação graduada do tropismo. Dependendo da probabilidade de o uso co-receptor, a interpretação de texto e a cor do fundo que varia do verde (<20% FPR), sugerindo uma administração segura de MVC, a amarela, sugerindo um risco, baixa possível e, finalmente, para o vermelho. Vermelho é a cor sugeremção não prescrever MVC. Além disso, o servidor gera um relatório pdf que pode ser impresso, preenchido com o paciente e os dados de amostra, e enviada para o médico. Exemplos de saída geno2pheno _[coreceptor] estão representados na Fig. 6.

Figura. 1. Replicação esquemática de HIV. O virião deve ligar-se às células CD4 como receptor celular e tanto ao CCR5 ou CXCR4 como co-receptor. O co-receptor CCR5 pode ser bloqueado com os antagonistas do CCR5 como Maraviroc (MVC, Celsentri, Selzentry). Após a fusão das membranas viral e celular, o nucleocapsídeo viral é libertado no citoplasma. A nucleocápside desmonta e do complexo de RNA viral é libertado para dentro do citoplasma. A transcriptase reversa virai (RT) transcreve o ARN genómico em ADN proviral, que é, então, transportado para o núcleo e integrado no genoma do hospedeiro pela integrase HIV. Cellular RNA polimerases transcribe genoma viral e RNA mensageiro a partir do genoma proviral. As proteínas virais são produzidas no citoplasma e transportada para a superfície celular. O vírus bud partículas como imaturas, não infecciosas viriões a partir das células. A protease de HIV cliva as proteínas produtoras de partículas infecciosas. A inibição de um dos passos leva a uma interrupção do ciclo de replicação.

As drogas anti-retrovirais e o passo que eles inibem a replicação são marcados a vermelho.

O RNA viral e DNA proviral (material utilizado para a análise tropismo ou resistência) estão marcados a verde.

A Figura 2. HIV genoma proviral. A partícula de HIV é construído com diferentes proteínas estruturais e enzimas diversas casas e proteínas, tanto de origem viral e celular. O show figuraé a localização dos genes dentro do genoma viral. A superfície de proteínas gp120 e gp41 constituem pontas sobre a superfície do virião e contactar a célula humana para realizar a fusão da membrana. Na parte inferior da figura, os produtos de amplificação por PCR e os iniciadores utilizados no nosso protocolo são mostrados.

Figura 3. Proporção de pacientes com carga viral baixa (VL) medidas analisadas para resistência a drogas ou determinação do tropismo no Instituto de Virologia da Universidade de Colônia (Alemanha).

Figura 4. Esquema geral do experimento .. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5. Sequência de edição com Lasergene. O amplicon V3 é sequenciado com, pelo menos, um para a frente e um iniciador inverso. Lasergene alignes os "ABI". Arquivos obtidos no seqüenciador com a referência de seqüências "Consenso V3-B" e env. Lasergene cria uma seqüência consenso com todos os dados da linha disponíveis. As sequências de referência podem ser marcados (e, em seguida, são apresentados a cinzento), de modo que não contribuem para a sequência de consenso da amostra.

Figura 6. Tropismo relatórios de previsão gerados pelo geno2pheno _{[co-receptor]} relatórios tool.The são gerados como arquivos PDF que podem ser salvos e preenchidos no computador. Dados adicionais nome do paciente nos tal, a data de extração de sangue, etc, podem ser incluídos manualmente usando um programa de escritor pdf. Comentários específicos também podem ser adicionados. Tsdados electrónicos são exclusivamente no computador do utilizador, e não sobre a _[coreceptor] geno2pheno servidor. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussion

A sequência V3 permite uma previsão fiável do tropismo viral, como demonstrado em estudos clínicos ^3-9. Na verdade, a determinação genotípica é contemplada nas diretrizes atuais europeus e germano-austríaca ^10.

Em comparação com testes fenotípicos, não só é o mais curto tempo de giro (equivalente ao teste de resistência), mas também os custos. Além disso, uma grande vantagem do teste de genotipagem é que os resultados são classificados como FPR e, portanto, pode ser adaptado às necessidades do paciente. Trofile resultados, por outro lado, são simplesmente relatórios R5 ou X4, e o acesso aos dados em bruto não é dada.

Atualmente, as orientações europeias sugerem um FPR de corte de 20 a ^10%, enquanto as diretrizes austríaco-alemãs permitem adaptar o FPR de corte especificamente para as necessidades de cada paciente ^11. Nesta linha, para pacientes com uma ampla gama de opções de medicamentos anti-retrovirais, maior FPR cut-offs (> 20%) são Recomterminou. Por outro lado, para pesadamente pré-tratados pacientes com poucas opções terapêuticas, inferior FPR pontos de corte (> 5%) pode ser usado. Este tipo de terapia é a orientação actualmente em curso, o teste de resistência de NRTIs, NNRTIs, PIs e inis, onde a droga parcialmente activos podem ser incluídos no tratamento de pacientes com reduzidas opções terapêuticas. Além disso, com um número crescente de mudanças terapia genotipicamente-guiadas, o clinicamente relevante FPR cut-offs estão constantemente a ser ajustado por um painel de bioinformáticos, virologistas e clínicos.

Outra importante vantagem do teste de tropismo genotípica é a possibilidade de analisar amostras clínicas com muito baixa ou mesmo não detectável de carga viral (VL). Nestes casos, quando o plasma RNA não é amplif icável, o ADN proviral pode ser sequenciado e usado para previsões confiáveis ^​​9,12. Digno de nota, o número de pacientes com baixos ou indetectáveis ​​de carga viral aumentou acentuadamente nos últimos anos. Até à data, o TERFIL ensaio só permite a análise de amostras de pacientes com VL <1000 cópias / ml. No entanto, estudos preliminares mostraram que o ADN proviral pode ser também adecuate a ser testado por Trofile ^13.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome do reagente	Companhia	Número de catálogo	Comentários
Magna Pure Isolation Kit Compacto de Ácido Nucleico I	Roche Diagnostics	04 802 993 001
Sistema Pure Magna Compact	Roche Diagnostics	03731146001
T3000 Termociclador	Biometra	050-723
One Step RT-PCR Kit	Qiagen	210215
HotStarTaq Mix Master Kit	Qiagen	203445
QIAquick PCR Purification Kit	Qiagen	28106
Exonuclease I (Exo I)	Fermentas	EN0582
Fastap Fosfatase Alcalina termossensível	Fermentas	EF0651
Big Dye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit	Applied Biosystems	4337457
Sephadex G-50 Superfine	GE Healthcare	17-0041-01
Seqüenciador ABI Prism 3130 XL capilar	Applied Biosystems	3130XL