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Derivação eficiente dos recursos humanos Precursores cardíaca e Cardiomyocytes pluripotentes a partir de células estaminais embrionárias humanas com a indução de moléculas pequenas

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DOI:

10.3791/3274

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3 de novembro de 2011

 ,  ,  ,  ,  , 
1San Diego Regenerative Medicine Institute, 2Xcelthera, 3Department of Neurosurgery, Harvard Medical School, 4Division of SCI Research, VA Boston Healthcare System, 5Program in Stem Cell & Regenerative Biology, Sanford-Burnham Medical Research Institute, 6La Jolla IVF

Neste artigo

Resumo

Nós estabelecemos um protocolo para indução de cardioblasts direta de pluripotentes células estaminais embrionárias humanas mantidas sob condições definidas com pequenas moléculas, que permite a derivação de uma grande oferta de recursos humanos progenitores cardíaca e funcional cardiovascular cardiomiócitos para reparação.

Resumo

Até o momento, a falta de uma fonte de células adequado cardíaco humano tem sido o grande revés na regeneração do miocárdio humano, seja por celular baseado em transplante cardíaco ou por engenharia tecidual 1-3. Cardiomiócitos se tornar terminalmente diferenciadas logo após o nascimento e perdem a capacidade de proliferar. Não há evidências de que haste / progenitor células derivadas de outras fontes, tais como a medula óssea ou do sangue do cordão umbilical, são capazes de dar origem a células musculares de contração do coração após o transplante para o coração 1-3. A necessidade de regenerar ou reparar o músculo cardíaco danificado não foi cumprido pela terapia de células-tronco adultas, seja endógena ou através da entrega de célula 1-3. O geneticamente estáveis ​​células estaminais embrionárias humanas (hESCs) têm capacidade de expansão ilimitada e irrestrita plasticidade, proferindo um reservatório pluripotentes no derivação in vitro de grandes quantidades de células somáticas humanas que são restritos à linhagem em necessidadede reparo e regeneração 4,5. Devido à prevalência de doença cardiovascular em todo o mundo e aguda escassez de doadores de órgãos, existe grande interesse em terapias CTEh baseado em desenvolvimento como uma abordagem alternativa. No entanto, como canalizar o potencial de diferenciação gama de hESCs pluripotentes de forma eficiente e previsível para um fenótipo desejado tem sido um grande desafio tanto para estudo de desenvolvimento e tradução clínica. Abordagens convencionais dependem de multi-linhagem inclinação de células pluripotentes através da diferenciação espontânea germe de camada, resultando em ineficiência e incontrolável linhagem compromisso, que é muitas vezes seguido de heterogeneidade fenotípica e instabilidade, portanto, um risco elevado de tumorigenicidade 6-8 (ver um esquema em fig. 1A). Além disso, indefinido estrangeiros / animal suplementos biológicos e / ou alimentadores que tenham sido tipicamente usadas para o isolamento, expansão e diferenciação de hESCs pode fazer uso direto de tais células-specialized enxertos em pacientes problemáticos 9-11. Para superar esses obstáculos, temos resolvido os elementos de um sistema de cultura definidas necessárias e suficientes para sustentar o epiblasto pluripotence de hESCs, servindo como uma plataforma para a derivação de novo de hESCs clinicamente adequado e eficaz direcionando hESCs tais uniformemente para linhagens clinicamente relevante por pequenas moléculas 12 (ver um diagrama esquemático na fig. 1B). Após a triagem de uma variedade de pequenas moléculas e fatores de crescimento, verificou-se que tais condições definidas prestados nicotinamida (NAM) suficiente para induzir a especificação de cardiomesoderm direta de hESCs pluripotentes que mais progrediu para cardioblasts que gerou humana cardiomiócitos batendo com alta eficiência (Fig. 2 ). Nós definimos as condições para a indução de cardioblasts direta de hESCs pluripotentes sem uma intervenção multi-estágio corpo linhagem embrióides, permitindo bem controlados derivação eficiente de umgrande oferta de células cardíacas humanas em todo o espectro de estágios de desenvolvimento para a célula-base terapêutica.

Protocolo

1. Solução e Mídia Preparação

  1. Solução de revestimento de gelatina: 0,1% (w / v) de gelatina em DDH 2 O, autoclavado e armazenar a 4 ° C.
  2. Matrigel soluções de revestimento. Solução estoque: lento degelo Matrigel (10 ml) a 4 ° C durante a noite, adicionar 10 ml gelada DMEM ou DMEM/F12, misture bem e alíquota de 1 ml / tubo sob capô de cultura de tecidos esterilizados, armazenar a -20 ° C. Solução de trabalho: descongele lenta 1 ml alíquota Matrigel a 4 ° C por 1-2 horas a transferência, a 14 ml ou refrigerados DMEM DMEM/F12 e misture bem debaixo capa de cultura de tecidos esterilizados imediatamente antes de revestimento.
  3. Solução de revestimento laminina humana: diluir 1 ml de solução de laminina humana (0,5 mg / ml em Tris Buffered NaCl, armazenar a -80 ° C, degelo lento a 4 ° C por 1-2 horas) com gelado DMEM ou DMEM/F12 para 12,5 ml de solução de trabalho (40 mcg / ml) por baixo capota de cultura de tecidos esterilizados imediatamente antes de revestimento.
  4. Soluções estoque de fator de crescimento (500-1000x): dissolver o fator de crescimento de 10 mg/ Ml em tampão esterilizado (0,5% BSA, 1,0 mM DTT, glicerol 10%, 1XPBS) e armazenar como 50-100 mL / tubo de alíquotas a -80 ° C.
  5. Media células estaminais embrionárias humanas: DMEM/F12 ou KO-DMEM (80%), KO substituição de soro (20%), L-alanil-L-gln ou L-gln (2 mM), MEM aminoácidos não essenciais (MNAA, 1X), e β-mercaptoetanol (100 mM), filtrado e armazenar a 4 ° C, suplementado com 20 ng / ml bFGF antes de usar. Ou substituição de "KO substituição do soro" com componentes definidos: DMEM/F12 ou KO-DMEM (100%), L-alanil-L-gln ou L-gln (2 mM), MNAA (1X), MEM aminoácidos essenciais (MEAA , 1X), e β-mercaptoetanol (100 mM), filtrado e armazenar a 4 ° C, suplementado com bFGF (20 ng / ml), a insulina humana (20 mcg / ml), ácido ascórbico (50 mg / ml), humanos ativina A (50 ng / ml), albumina humana Albumax / (10 mg / ml), e transferrina humana (8 mcg / ml) antes de usar.
  6. Media células estaminais embrionárias humanas cardíaca diferenciação: DMEM/F12 (90%), FBS definida (10%), e L-alanil-L-gln ou L-gln (2 mM).
  7. Mídia contendo nicotinamida (NAM): adicionar NAM células estaminais embrionárias humanas para a mídia ou a mídia células estaminais embrionárias humanas cardíaca diferenciação para concentração final de 10 mM, filtrado loja, a 4 ° C e usar dentro de 2 semanas de preparação.

2. Revestimento placa

  1. Placas de revestimento com gelatina: adicionar 2,5 ml / poço de solução de gelatina a 6 placas bem e incubar durante a noite em uma incubadora de 37 ° C umidificado.
  2. Placas de revestimento com laminina: frio de gelatina revestidos e remover placas de gelatina, adicione 2,5 ml / solução de revestimento bem Matrigel ou humano laminina trabalhando para pré-gelatinizado refrigerados 6-bem placas e incubar a 4 ° C durante a noite.

3. Passaging e propagação hESCs indiferenciado sob condições definidas

  1. Permitir colônias CTEh crescer até 5-7 dias de idade, e ter placa de cultura CTEh para microscópio de dissecação (pré-aquecido dissecar palco para 37 ° C) por baixo de dissecação capô esterilizados.
  2. Selecione colônias CTEh a ser dividido. Morfologicamente, essas colônias devem ter> 75% hESCs indiferenciada (smtodas as células compactas), geralmente um pouco opaco (não-brancos empilhados células não diferenciadas células claras) com borda definida sob o microscópio de dissecação. Cuidadosamente delinear as colônias selecionadas e remover camada de fibroblastos diferenciados em torno da colônia e todas as partes diferenciadas (se houver) da colônia com a borda da P2 ponteira estéril ou puxado capilar de vidro.
  3. Remover a velha mídia contendo flutuante destacada células diferenciadas por aspiração. Lavar com media hESC (sem bFGF) uma vez. Adicionar 3 ml / media CTEh bem fresco contendo 20 ng / ml bFGF.
  4. Cortar as colônias CTEh indiferenciado em pequenos pedaços, e retire com ponteira estéril ou vidro puxado capilar.
  5. Piscina a mídia que contém peças colônia separada juntos em um tubo de 50 ml. Lave a placa uma vez com 1 ml / media CTEh bem contendo 20 ng / ml bFGF e piscina juntos.
  6. Aspirar o Matrigel ou solução laminina humana, desde as placas revestidas fresco. Alíquota de 4 ml / h bemESC mídia contendo peças colônia para uma placa de seis poços. Suavemente transferir a placa para incubadora, sem agitação e permitir semente peças colônia durante a noite sem perturbar em um umidificado 37 ° C incubadora com uma atmosfera de 5% de CO 2.

4. Indução cardíaca de hESCs em Sistema Cultura Definido com Nicotinamida

  1. No dia 3 após a semeadura, remover a maior parte velha mídia de cada poço da placa e deixe a mídia o suficiente para permitir colônias CTEh a ser submersa (nunca permitir hESCs a secar). Substituir com 4 ml / media CTEh bem fresco contendo 20 ng / ml bFGF e 10 mM nicotinamida (NAM).
  2. Substituir a velha mídia com a mídia CTEh fresco contendo 20 ng / ml e 10 mM bFGF NAM cada dois dias, e permitir que as colônias cardíaca induzida CTEh crescer para 10/08 dias. Após expor a NAM, todas as células dentro da colônia vai sofrer alterações morfologia de grandes células diferenciadas que continuarão a se multiplicar. As colónias aumentarão de tamanho, e por 8-10 dias, umcélulas d começará a se acumular em algumas áreas das colônias.

5. Continuando Diferenciação Cardíaca em Cultura Suspensão

  1. Tome placa CTEh cultura para dissecar microscópio (pré-aquecido dissecar palco para 37 ° C) por baixo de dissecação capô esterilizados. Cuidadosamente delinear as colônias e remover camada de fibroblastos ao redor da colônia (células diferenciadas migraram para fora da colônia) com a borda da ponta da pipeta estéril ou P2 puxado capilar de vidro.
  2. Remover a velha mídia contendo flutuante células de fibroblastos destacado por aspiração. Lavar com media hESC (sem bFGF) uma vez. Adicionar 3 ml / media CTEh bem fresco (sem bFGF).
  3. Cortar as colônias cardíaca induzida CTEh em pequenos pedaços, e retire com ponteira estéril ou vidro puxado capilar.
  4. Piscina a mídia que contém peças colônia separada juntos em um tubo de 50 ml. Lave a placa uma vez com 1 ml / media CTEh bem (sem bFGF) e piscina juntos.
  5. Alíquota de 4 ml / poço media sem soro CTEh contendo peças colônia para uma placa de fixação 6-ultralow bem e incubar a 37 ° C umidificado incubadora para permitir flutuante aglomerados celulares (cardioblasts) para formar por 4-5 dias.

6. Maturação batendo Fenótipo Cardiomyocyte em Cultura Adhesive

  1. Piscina a mídia que contém cardioblasts flutuando juntos em um tubo de 50 ml. Centrifugar a 1400 rpm por 5 min. Aspirar a velha mídia, tanto quanto você pode e adicionar uma quantidade igual de novo CTEh media diferenciação cardíaca contendo 10 mM NAM.
  2. Pipeta cima e para baixo para misturar cardioblasts flutuante e alíquota de 4 ml / poço a 6-lamelas. Transferir os pratos para a 37 ° C incubadora umidificada para permitir cardioblasts anexar durante a noite.
  3. Substituirá a mídia CTEh cardíaca diferenciação contendo 10 mM NAM em dias alternados.
  4. No dia 8, substitua com a mídia CTEh cardíaca diferenciação sem NAM, e continuam a substituir células estaminais embrionárias humanas cardíaca diferenciação de mídia edia muito outros. Cardiomiócitos batendo começarão a aparecer em cerca de 1-2 semanas de cultivo contínuo após a retirada do NAM e aumentar em número com o tempo, e poderia manter fortes contrações rítmicas e por mais de 3 meses.

7. Resultados representativos:

Nicotinamida (NAM) é processada suficiente para induzir hESCs mantido no sistema de cultura definida para a transição de pluripotência exclusivamente a um fenótipo cardiomesodermal (Fig. 2B). Após a exposição de hESCs indiferenciado para NAM, todas as células dentro da colônia vai sofrer alterações morfologia de grandes células diferenciadas que baixo-regulam a expressão de Oct-4 e começam a expressar o fator de transcrição cardíacas específicas (CSX) Nkx2.5 e α- actinina, consistente com um fenótipo cardiomesoderm (Fig. 2B). Estas células diferenciadas continuarão a se multiplicar e as colônias aumentam de tamanho. Aumento da intensidade das Nkx2.5 vaigeralmente ser observado nas áreas das colônias, onde as células começam a se acumular (Fig. 2B). Depois de separado, o hESCs NAM-tratados formarão flutuante aglomerados celulares (cardioblasts) em uma cultura de suspensão para continuar o processo de diferenciação cardíaca. Depois de permitir a cardioblasts para anexar e continuar a tratar com NAM por 1 semana, batendo cardiomiócitos começarão a aparecer em cerca de 1-2 semanas de cultivo contínuo após a retirada do NAM com um aumento drástico em termos de eficiência, em comparação com diferenciação multi-linhagem espontânea de hESCs sem tratamento sobre o mesmo período de tempo (Fig. 2C). Células dentro dos clusters vai bater cardiomiócitos expressam marcadores característicos de cardiomiócitos, incluindo Nkx2.5 e α-actinina (Fig. 2C). As contrações dos cardiomiócitos batendo foram confirmados por perfis elétricos para ser forte, rítmica, bem coordenada e bem arrastado, com impulsos regulares lembra do p-QRS-T-complexos de visto a partir de eletrodos de superfície do corpo em clínica eletrocardiogramas (Fig. 2C, também ver o vídeo). Os cardiomiócitos poderia manter a sua contratilidade forte por mais de 3 meses.

Figura 1
Figura 1. Esquemas geral da abordagem convencional versus abordagem de pequena molécula de indução de diferenciação de células-tronco humanas pluripotentes para células especializadas funcional. (A) Um esquema de abordagem convencional, usando multi-linhagem inclinação de células-tronco humanas pluripotentes através da diferenciação espontânea germe de camada. (B) Um esquema de bem-controlados de indução eficiente de células-tronco pluripotentes humanas exclusivamente a uma linhagem particular clinicamente relevante pelo simples fornecimento de pequenas moléculas.

Figura 2
Figura 2. Nicotinamida induz especificação linhagem cardíaca direta de pluripotência em condições definidas e progressão para bater cardiomiócitos. (A) Esquema mostrando a linha do tempo de protocolo de diferenciação dirigida cardíaca de hESCs. (B) Após a exposição de hESCs indiferenciada a nicotinamida (NAM), sob o sistema de cultura definido, grande diferenciados Oct-4 (vermelho) células negativas dentro da colônia começaram a surgir, em comparação com o mock-tratados (DMSO) hESCs como controle. NAM induzida por células Oct-4-negativos começaram a expressar Nkx2.5 (verde) e α-actinina (vermelho), de acordo com a diferenciação cardíaca precoce. Intensidade progressivamente aumentado de Nkx2.5 era normalmente observada em áreas da colônia onde as células começaram a se acumular. Todas as células são indicados por DAPI coloração de seus núcleos (azul). (C) NAM-cardíaca induzida comprometido hESCs rendeu cardiomiócitos batendo com um aumento drástico em termos de eficiência, avaliada pela clus celularters que mostrava contrações rítmicas (ver perfil eletrofisiológicos e vídeos), e imunopositivas para Nkx2.5 (verde) e α-actinina (vermelho). Imagens da fase de grupos representativos de bater grandes cardiomiócitos e imagens de maior poder de representante contrair músculos cardíacos são mostrados (veja também vídeos correspondente). As setas indicam o cluster cardiomiócitos grande batendo utilizado para a gravação eletrofisiológico. Perfil eletrofisiológico dos cardiomiócitos bater mostra regular, arrastado, impulsos rítmicos reminiscência da p-QRS-T-complexos visto em eletrocardiogramas clínicos. Barras de escala: 0,1 mm.

Vídeos: Entidade cardiomiócitos diferenciados NAM induzida hESCs. Vídeos 1 e 2 mostram representante vídeo batendo grandes aglomerados de cardiomiócitos em cerca de 1 e 3 meses após a fixação. Video 3 e 4 mostram representante contraindo os músculos cardíacos com maior poder. 5 mostra uma typical aglomerado de cardiomiócitos pequenos batendo espontaneamente diferenciado de hESCs NAM sem tratamento como controle.

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Discussão

Um dos grandes desafios tanto para estudos de desenvolvimento e tradução clínica tem sido a forma de canalizar o potencial de diferenciação gama de células-tronco pluripotentes humanas a um fenótipo desejado de forma eficiente e previsível. Apesar de tais células podem se diferenciar espontaneamente in vitro em células de todas as camadas germinativas, passando por uma fase agregado multi-linhagem, em CTEh derivados multi-linhagem agregados (corpos embrióides), apenas uma fração muito pequena de células (<2%) espontaneamente diferenciar em cardiomiócitos 13-15 (Fig. 1A). Immunoselection seguintes, a população enriquecida de cardiomiócitos foram capazes de funcionar como marca-passos biológicos para resgatar a função de um miocárdio danificado mecanicamente e eletronicamente após a injeção no coração de modelos animais 13. Em modelos de roedores infartada, enxertada CTEh progênies derivadas cardíacos foram capazes de sobreviver e amadurecer até 12 semanas, e parcialmente remuscularize o coração ferido e melhorar a função contrátil 14,15. No entanto, a ineficiência na geração cardíaco humano comprometido células através de multi-linhagem diferenciação de células pluripotentes e alto risco de transplante tumorigenicidade seguintes têm impedido de nova tradução clínica. Desenvolvimento de estratégias para canalizar o potencial de diferenciação gama de hESCs pluripotentes exclusiva e previsivelmente a um fenótipo cardíaco é vital para aproveitar o poder da biologia CTEh no campo do coração. A fim de alcançar uniformemente conversão de células pluripotentes estaminais humanas a uma linhagem especial, empregamos um sistema de cultura definido capaz de segurar a proliferação de hESCs indiferenciado para identificar as condições para o bem-controlados de indução eficiente de hESCs pluripotentes exclusivamente para uma determinada linhagem clinicamente relevante pelo simples fornecimento de pequenas moléculas (Fig. 1B). Descobrimos que a nicotinamida induzida comprometimento cardíaco de linhagem direta de phESCs luripotent sob cultura definido que mais progrediu para bater cardiomiócitos com alta eficiência (Fig. 2). Nkx2.5 é um fator de transcrição evolutivamente conservada homeobox indispensável para o desenvolvimento cardíaca normal e mutações do gene são associadas à doença cardíaca humana congênitas (CC), o defeito de nascimento mais comuns humana 16. Expressão de Nkx2.5 é o primeiro marcador de células precursoras de coração em todos os vertebrados, até agora examinado e é essencial para a septação cardíaca adequada e formação / amadurecimento do sistema de condução elétrica 16. Nos vertebrados, o início eo padrão de expressão Nkx2.5 início cerca de coincidir com o calendário e área de especificação na embriogênese cardíaca precoce, e Nkx2.5 gene continua a ser expressa através do desenvolvimento no coração 16. Em nosso modelo CTEh, NAM apareceu para acionar a indução direta de hESCs cardíaca pluripotentes através da promoção da expressão de cardíacas específicas transcriNkx2.5 PÇÃO fator em um processo que pode emular a especificação de cardiomesoderm do epiblasto pluripotentes em cardiogenesis embrionárias humanas. Futuros estudos revelarão moléculas controle genéticas e epigenéticas no desenvolvimento coração humano como alternativas, que podem pavimentar o caminho para o controle de molécula pequena mediada direta e modulação do destino pluripotentes CTEh quando derivar linhagens clinicamente relevantes para terapias regenerativas. Sem tratamento NAM, 12-15. Com o tratamento NAM, temos sido capazes de gerar> 95% embrionárias precursores cardíacos e cardiomiócitos batendo> 50% de hESCs mantido sob uma cultura define em um processo que pode emular o desenvolvimento embrionário do coração humano 12. Recentemente, conhecido destino cardíacas genes determinantes têm sido usados ​​para transdifferentiate fibroblastos de rato em pós-natal cardiomiócitos batendo com uma baixa eficiência de <0,5% 17, 18 </ Sup>. No entanto, as células somáticas reprogramadas têm sido historicamente associada com a expressão do gene anormal e senescência acelerada com utilidade terapêutica prejudicada 19-21. Finalmente, o protocolo que estabelecemos aqui é limitado a hESCs pluripotentes derivadas da massa celular interna (ICM) ou epiblasto do blastocisto humano 4,5, pode não se aplicar a outras células pluripotentes, incluindo animais originou-CES, CES derivado de mórula anterior (oito células) em estágio embriões 22, e as células reprogramadas artificialmente 23.

Divulgações

Os autores declaram interesses conflitantes. XHP é o fundador da Xcelthera. XHP e EYS têm propriedades intelectuais relacionadas com hESCs.

Agradecimentos

XHP foi apoiado pelo National Institute of Health (NIH) doações do National Institute on Aging (NIHK01AG024496) e A Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health e Desenvolvimento Humano (NIHR21HD056530).

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Nome do reagente Companhia Número de catálogo Comments (opcional)
Gelatina Sigma G1890
Matrigel BD biociência 356231 Fator de crescimento reduzida
Laminina humana Sigma L6274
Nicotinamida Sigma N0636
DMEM/F12 Invitrogen 10565042
DMEM Invitrogen 31053036
DMEM-KO Invitrogen 10829018
Knock-out substituição de soro Invitrogen 10828028
MEM solução aminoácido não essencial (MNAA, 100X) Invitrogen 11140050
MEM solução de aminoácidos (MEAA, 100X) Invitrogen 11130050
β-mercaptoetanol Invitrogen 21985023
Albumax Invitrogen 11020021
Ácido ascórbico Sigma A4403
Transferrina humana Sigma T8158
Humana bFGF PeproTech AF-100-18B
Insulina humana Invitrogen 12585014
Humana ativina A PeproTech 120-14E
FBS definido Hyclone SH30073-03
6-bem placa de fixação ultralow Corning 3471
6 bem-placa Corning 3516

Referências

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