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Medicine

Une technique simplifiée pour produire un modèle de plaie ischémique

Published: May 2, 2012 doi: 10.3791/3341
Automatic Translation
1, 1
1Department of Surgery, University of Louisville

Summary

Nous avons développé une technique mini-invasive pour créer un lapin modèle ischémique plaie oreille en divisant l'artère centrale et le nerf et le paquet vasculo-nerveux crânienne. Un tunnel sous-cutané coupe alors tous les tissus sous-cutanés. Cette procédure entraîne des perturbations minimes et la peau peut être utilisé sans danger chez les animaux diabétiques.

Abstract

Un obstacle majeur dans la recherche actuelle plaie diabétique est l'absence d'un modèle de plaie ischémique qui peut être utilisé sans danger chez les animaux diabétiques. Les médicaments qui fonctionnent bien dans les plaies ischémiques non-peuvent ne pas fonctionner dans les plaies diabétiques de l'homme parce vasculopathie est un facteur majeur qui entrave la guérison de ces blessures. Nous avons publié un article en 2007 décrivant une oreille de lapin plaie ischémique modèle créé par une technique chirurgicale minimalement invasive. Depuis lors, nous avons encore simplifié la procédure pour faciliter l'opération. Sur une oreille, trois petites incisions cutanées ont été faites sur les pédicules vasculaires, de 1-2 cm de la base de l'oreille. L'artère centrale a été ligaturé et couper le long du nerf. Le faisceau a été coupé toute crânienne et ligaturé, ne laissant que la branche caudale intacte. Un tunnel sous-cutanée périphérique a été faite par les incisions, pour couper les tissus sous-cutanés, les muscles, les nerfs et les vaisseaux de petite taille. L'autre oreille a été utilisé comme un contrôle non-ischémique. Quatre blessures ont été faites sur la face ventrale of chaque oreille. Cette technique produit 4 plaies ischémiques et non ischémiques 4 blessures à un animal pour des comparaisons par paires. Après la chirurgie, l'oreille ischémique était fraîche et cyanosé, et a montré le mouvement réduit et un manque d'impulsion dans l'artère oreille. Température de la peau de l'oreille ischémique était 1-10 ° C inférieure à celle sur l'oreille normale et cette différence a été maintenue pendant plus d'un mois. Ear contenu tissus phosphate à haute énergie ont été plus faibles dans l'oreille ischémique que l'oreille de contrôle. Fois la cicatrisation des plaies était plus longue dans l'oreille ischémique que dans l'oreille non-ischémique quand le même traitement a été utilisé. La technique a été utilisée sur plus de 80 lapins dans lequel 23 étaient diabétiques (le diabète de temps allant de 2 semaines à 2 ans). Pas de lapin seul a développé des complications chirurgicales comme des saignements, une infection ou une rupture dans les incisions cutanées. Le modèle présente de nombreux avantages, comme la perturbation peu de peau, le temps plus ischémique, et le taux de réussite plus élevé, par rapport à beaucoup d'autres modèles. Il can être utilisé sans danger chez les animaux présentant une résistance réduite, et peut également être modifié pour répondre aux exigences d'essai différentes.

Protocol

1. Base anatomique

L'oreille de lapin a été un matériau privilégié pour l'étude le soin des plaies depuis le début du 20 ème siècle. L'oreille est fournie par trois faisceaux vasculaires (central, crânienne, et caudale); le faisceau central est le plus grand, tandis que les navires dans les faisceaux crânienne et caudale sont de taille variable. Parfois, l'artère caudale peut être absent. 1 Tous ces navires sont facilement identifiables sur la face dorsale après l'oreille est rasée (Fig. 1). Sur la face ventrale, la peau distale ne reçoit pas l'approvisionnement en sang des vaisseaux proximaux. Les trois faisceaux des navires sur l'oreille dorsale ont de nombreuses branches qui pénètrent à travers le cartilage de fournir l'approvisionnement en sang à la peau ventrale distale (Fig. 2). Chez des lapins, un récipient très petite sous-cutanée se produit également sur le côté ventral, qui fournit le sang à pas plus de 1/3 de la peau ventrale. Dans une incision cutanée périphérique ouvert, il est essentiellement pas de saignement à partir d'une incision ventrale.

2. Procédure chirurgicale

  1. Le lapin est pesé et les oreilles sont rasés, avec l'arrière du cou.
  2. Une prémédication de la buprénorphine (0,01 mg / kg) est administrée IM une heure avant la chirurgie.
  3. L'anesthésie est induite par un mélange de kétamine (50 mg / kg) et de xylazine (5 mg / kg) IM.
  4. Le lapin est protégé par un coussin chauffant pendant la chirurgie, les yeux sont protégés avec un onguent, et ses signes vitaux sont surveillés pendant la chirurgie.
  5. Le champ opératoire est préparé de manière aseptique à un gommage chirurgicale et drapé de telle sorte que les deux oreilles sont exposés.
  6. Une oreille est rendue ischémique, tandis que l'autre oreille sert de paires non-ischémique de contrôle.
  7. Les trois pédicules vasculaires sont identifiés par les artères et les veines.
  8. En utilisant une lame n ° 15, trois petites incisions verticales (1-1,5 cm) sont réalisés sur des pédicules vasculaires, environ 1-2 cm de la base de l'oreille.
  9. La veine centrale estisolés à partir des tissus environnants et un fil de suture est utilisé pour l'encercler pour le retrait. L'artère centrale est ligaturé avec des sutures 4-0 et divisé.
  10. Le nerf central d'accompagnement est également coupé.
  11. Le pédicule toute crânienne est ligaturée et sectionnée.
  12. Le pédicule caudal est préservée.
  13. Un tunnel sous-cutané est effectuée par les incisions 3. Ceci est accompli par dissection avec une pince et les dissections pointues avec un couteau et des ciseaux. Tous les tissus sous-cutanés, les muscles, les nerfs, et les petites branches vasculaires sont interrompues. Les vascularisations petites dessous du derme sont totalement divisée. Tous les tissus sous-cutanés sont coupés au niveau du cartilage avec la lame.
  14. Dissections plus nettes et franches sont utilisés pour nettoyer la base, laissant un cartilage nue environ 5-10 mm de large.
  15. Cette procédure interrompt toutes les branches vasculaires sous-cutanés pour les empêcher de collatéraux établir rapidement.
  16. Le saignement estminimale. Si il n'y a aucune, il est facilement contrôlée par compression de gaze, sans la nécessité d'électrocoagulation.
  17. La peau à l'intérieur de l'oreille ne porte pas l'offre beaucoup de sang et n'est donc pas incisé.
  18. Les 3 incisions cutanées sont fermées par des sutures 4-0 ou 5-0, et recouverte d'une gaze stérile.
  19. Les résultats de la procédure en 3 petites incisions cutanées et subit des dommages beaucoup de peau à moins d'une chirurgie ouverte.
  20. Quatre circulaires plaies cutanées de pleine épaisseur sont créés sur la face ventrale de chaque oreille avec un poinçon de 6 mm en acier inoxydable. La distance entre les blessures est d'au moins 20-30 mm. La peau à l'intérieur du poinçon plaie est retiré du cartilage. Le périchondre est également supprimé, avec la peau ou séparément. La base sur laquelle la granulation et l'épithélialisation lieu est le cartilage, le cartilage, mais n'est pas perforée (fig. 3).
  21. Lorsque les plaies sur les deux oreilles sont terminées, des médicaments test est appliqué sur un côté de deux plaies tandis que le médicament est de commande applIED aux blessures de l'autre côté. Un pansement occlusif (Tegaderm, 3M) est utilisé pour couvrir le site de la plaie. Cela empêche les blessures de devenir déshydratée.
  22. Les plaies à la partie inférieure de l'oreille normalement accélérer la cicatrisation de la blessure au haut de l'oreille. Pour une étude de comparaison de cicatrisation des plaies, il est recommandé de comparer les deux blessures sur un côté avec les deux plaies de l'autre côté, ou de comparer le haut et le bas séparément blessures.

3. Soins post-opératoires

  1. Un patch Duragesic est attachée à la peau du dos pour libérer fentanyl (25 pg / heure) pendant 2-3 jours pour réduire la douleur possible.
  2. Les lapins ont libre accès à la nourriture et la boisson.
  3. Les changements de pansement sont effectuées quotidiennement. Les pansements anciens sont supprimés et les plaies sont nettoyées avec des cotons-tiges stériles. Les photos numériques sont prises aux fins de comparaison. Nouveaux pansements sont appliqués, et les blessures sont couverts de nouveau par Tegaderm. Aucune anesthésie n'est nécessaire pendant l'habillage changes.
  4. Température de la peau est mesurée quotidiennement sur chaque oreille pour la comparaison.
  5. Complémentaires de circulation sanguin de l'oreille peut être mesurée avec un tensiomètre transcutanée en oxygène ou un débitmètre laser Doppler.
  6. Les sutures peuvent être retirés au bout d'une semaine.
  7. Pour les non-diabétiques animaux, la plupart des blessures se cicatrisent généralement d'oreille dans les 2-3 semaines.

4. Les complications possibles et comment les éviter

Cette chirurgie mini-invasive est sûr et les complications sont rares. Sauf pour une période de transition post-opératoire oedème de l'oreille doux, aucun de nos lapins a eu des complications graves chirurgicales. Néanmoins, il existe plusieurs complications potentielles de cette procédure:

  1. Saignement. Le saignement peut se produire dans les incisions si l'hémostase est incomplète ou si un navire plus grand sang (tels que l'un des principaux vaisseaux pédiculaires) est endommagé. Ceci est facilement évitée par une dissection minutieuse. En plus des trois principaux faisceaux vasculaires, là unre de nombreux mineurs branches sous-cutanées vasculaires. Lorsque le tunnel sous-cutané est faite, ces navires sont réduits, mais pas de vente liée est nécessaire. L'hémostase peut être obtenue simplement en appuyant sur la gaze. Ceci se fait facilement en insérant un coin de la gaze dans le tunnel pendant quelques minutes. Avant de fermer l'incision, assurez-vous que pas de saignement actif est présent.
  2. L'infection et la déhiscence Incision: Ces complications peuvent se produire si les incisions sont contaminés. Ceci peut être évité par l'utilisation d'une technique aseptique stricte et aucun antibiotique est nécessaire. Toutefois, si l'infection ne se produit, système de drainage approprié et les changements de pansement sont nécessaires.
  3. Oedème de l'oreille: En raison de ligatures vasculaires et des perturbations de la circulation de la lymphe, oedème de l'oreille moyenne peut présenter pour quelques jours. Cependant, il disparaît par lui-même et aucun traitement n'est nécessaire.

5. Les résultats représentatifs

Depuis 2007, nous avons utilisé cette procédure dans plus de 70 lapins, dont 23 diabétiques uneimals. Dans le groupe des diabétiques, la chirurgie a été effectuée à des moments différents diabétiques: sept lapins ont eu deux semaines de temps diabétique, quatre d'entre eux disposaient de deux mois, dix avaient 12 mois, et 2 ont eu 24 mois de temps diabétique.

Immédiatement après la chirurgie, l'oreille ischémique est apparu frais et cyanosé, avec un léger œdème. L'oreille la plus importante artère de la centrale-artère a une forte impulsion à l'oreille normale, mais cette impulsion n'était pas présent dans l'oreille ischémique. Mouvement d'oreille a été réduit, mais n'a pas totalement disparu. La peau a montré dépressions claires sur le tunnel, mais pas d'ischémie ou de nécrose a été trouvé dans n'importe quel animal (Fig. 4).

Les températures de la peau des oreilles normales et ischémique ont été mesurées avec un thermomètre numérique (Omron par Omron Healthcare, Bannockburn, IL, ou un type K Thermomètre infrarouge place par Fisher Scientific, Pittsburgh, PA). Les différences de température entre l'oreille non-ischémiques et ischémique variait de 1 à 10 ° C, wvec la plupart des lapins tombant dans l'intervalle de 2-6 ° C. Fig. La figure 5 montre les différences de température moyenne de 30 lapins. La différence de température était plus élevée dans les premiers jours après la chirurgie, a diminué progressivement après 15 jours, mais il a été toujours maintenue à la fin d'un mois.

Le contenu de tissus phosphate à haute énergie ont été mesurées chez certains animaux après qu'ils ont été sacrifiés. Six échantillons de tissus ont été prélevés dans chaque oreille et le contenu de phosphate à haute énergie ont été mesurées par HPLC. Les deux ATP et les concentrations totales d'énergie ont été plus élevés dans les oreilles normales que dans les oreilles ischémiques. Fig. La figure 6 montre un exemple d'un lapin sacrifié 23 jours après la chirurgie. Les moyennes des tissus le contenu en ATP étaient 0,349 ± 0,047 mmol / g (moyenne ± écart type) dans l'oreille normale vs 0,237 ± 0,059 mmol / g dans l'oreille ischémique (p <0,005). Moyenne totale d'énergie (ATP + ADP + AMP) était 0,882 ± 0,137 mmol / g dans l'oreille normale vs 0,556 ± 0,115 mmol / g dans le ische micro oreille (p <0,001).

Fois la cicatrisation des plaies étaient toujours plus pour l'oreille ischémique que pour l'oreille non-ischémique dans tous les groupes (non-diabétique ou diabétique). Fig. 7 montre une comparaison de la guérison entre les 26 paires de blessures sur les oreilles ischémiques et non ischémiques. Temps de guérison varie de 13 à 18 jours (moyenne de 14,9 ± 1,6 jours) sur les oreilles normales vs 17 à 27 jours (moyenne 20,5 ± 3,4 jours) sur les oreilles ischémiques (p = 0,001). Fois la cicatrisation des plaies chez les lapins âgés et diabétiques étaient beaucoup plus, surtout quand le temps était diabétique de plus de 12 mois.

Dans ces lapins, tous les incisions guéries normalement sans aucune complication, y compris les lapins avec 24 mois de temps diabétiques. Figure 8 est un échantillon histologique montrant le tunnel sous-cutanée guérie dans laquelle le muscle est absent et est remplacé par des tissus fibreux. Toutefois, la peau est intacte.

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Figure 1. L'oreille de lapin est alimenté par trois faisceaux vasculaires. La centrale est le plus grand, le crâne est plus petit, et le faisceau caudale est le plus petit. Ces navires sont facilement visibles sur la surface après l'oreille est rasée.

Figure 2
Figure 2. Les trois faisceaux de navires sur le sang d'approvisionnement oreille dorsale non seulement à la peau du dos, mais aussi à la peau ventrale à travers les vaisseaux pénétrants. La flèche montre les vaisseaux pénétrants à travers le cartilage. L'encart montre traverser la section de ces navires.

Figure 3
Figure 3. Quatre de 6 mm blessures sont créées sur la face ventrale de l'oreille, et le périchondre est également supprimé. La base sur laquelle la granulation et l'épithélialisation lieu est le cartilage, le cartilage, mais n'est pas perforée. Le smal 3 incisions cutanées l sont fermées par des perturbations très peu de la peau.

Figure 4
Figure 4. Fois les entailles de peau sont fermés, l'indentation sur le tunnel sous-cutané est clairement visible.

Figure 5
Figure 5. La différence moyenne de la peau de température entre l'oreille normale et ischémique chez 30 lapins. Les différentes plages de début de 7 ° C à 10 ° C après la chirurgie. La différence diminue progressivement mais toujours maintenue à l'extrémité d'un mois.

Figure 6
Figure 6. Oreille contenu tissus phosphate à haute énergie sont réduits dans l'oreille ischémique par rapport aux non-ischémique oreille à 23 jours après la chirurgie (p <0,001).

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Temps la figure 7. La cicatrisation des plaies est plus longue dans les oreilles ischémiques que les oreilles non-ischémiques (26 plaies chacun). La guérison est définie comme la restauration de l'intégrité des tissus blessés, à savoir la réépithélialisation complète des sites de la plaie.

Figure 8
Figure 8. Échantillon histologie montrant la partie oreille contenant tunnel sous-cutané. Le tissu cicatrisé est plus mince que l'oreille normale, le muscle squelettique d'origine est absent et est remplacé par les tissus fibreux. Toutefois, la peau est intacte.

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Discussion

Le diabète affecte 23,6 millions de personnes aux États-Unis, 2,3 et 15-20% de ces patients développent des ulcères du pied dans leur vie, 4,5 pour un coût de traitement annuel de plus de 25 milliards de dollars. 3,6 Cependant, même le meilleur disponible traitements atteindre seulement un taux de guérison de 50%, ce qui est souvent temporaire, 7 avec des taux de récidive aussi élevés que 66% chez les diabétiques. 3,6 Lorsque les ulcères chez les patients diabétiques, les complications majeures telles que l'infection et l'augmentation amputation de façon spectaculaire. Malgré près d'un siècle de recherches approfondies et le développement de milliers de produits de pansement, aucun n'a encore prouvé son efficacité. L'affirmation selon laquelle "les ulcères anciens en 1830 seront les ulcères plus âgés en 1860," faite dans l'un des premiers articles décrivant le traitement des plaies chroniques, est encore valable aujourd'hui. 8 Trouver un modèle animal approprié pour l'étude des plaies a été un défi majeur pour les scientifiques comme ainsi que pour les cliniciens. De nombreux modèles animaux ont été créésou suggéré pour l'étude des soins de la plaie, mais un modèle de plaie comparable à une maladie chronique, non-cicatrisation de la plaie humaine est inexistante. 9,10 C'est parce que tous les plaies diabétiques humains ont une combinaison de l'ischémie tissulaire, l'hyperglycémie chronique, le stress oxydatif, la neuropathie et colonisation bactérienne. L'ischémie peut ne pas être la première cause des ulcères du pied diabétique, mais il est la principale raison de la persistance de ces blessures, 11. C'est parce que les plaies ne guérissent pas dans les tissus qui ne saigne pas, alors ils ont presque toujours guérir dans les tissus qui saigne abondamment. 12-15 Malheureusement, aucun des modèles animaux actuellement utilisés plaies ischémiques n'a encore été utilisé avec succès chez l'animal diabétique, et ce a créé un obstacle majeur pour les essais de médicaments de la plaie. À petite échelle des essais cliniques de facteurs de croissance, tels que le bFGF, ont montré qu'ils soient très efficaces, mais ils sont inefficaces dans hypoxiques modèles d'ulcères cutanés. 16,17

Nous avons publié un article en 2007 décrivant un modèle de lapin ischémique oreille blessure qui a été utilisé avec succès chez l'animal diabétique. 18. La technique est un peu difficile à réaliser en raison d'une dissection minutieuse de la paquet vasculo-nerveux crânienne est nécessaire. Parce que ces navires sont de petite taille, leur contribution à la récupération postopératoire est négligeable. Depuis lors, nous avons simplifié la procédure en coupant le faisceau neurovasculaire toute crânienne. Pour comparer avec la procédure dans laquelle le faisceau crânienne a été préservée, il n'y avait pas de différence dans la guérison des plaies ou des complications d'oreille. Cette procédure modifiée minimalement invasive présente les avantages suivants: 1). Il est simple, sûre, et a un taux de réussite élevé, ce qui réduit la douleur et la souffrance pour les animaux. Aucune complication chirurgicale a eu lieu dans ces animaux, y compris quelques lapins avec 24 mois de temps diabétique; 2). Il a longtemps ischémique. Nos mesures ont indiqué une différence de température cutanée à l'extrémité d'un mois. Il est possible que ee dissection extensive tissu sous-cutané sans avoir besoin de suture des résultats de retour de tissus en formation de vaisseaux collatéraux retardée; 3). Il est très flexible. Parce que les trois faisceaux vasculaires sont tous sous contrôle chirurgical, ce modèle peut facilement être fait pour imiter divers plaies chroniques (voir ci-dessous); 4). Contrairement à la peau dans d'autres endroits, ces blessures n'ont pas les follicules pileux dans le lit de la plaie. La guérison est totalement à partir du bord enroulé; 5). Cette procédure crée 4 plaies ischémiques et non ischémiques 4 plaies chez le lapin de même pour la comparaison par paires, ce qui réduit les variations individuelles; 6). Contraction de la peau est minime. Bien que la peau du dos de l'oreille de lapin a une certaine mobilité, la peau ventrale est une attelle par le cartilage, ce qui permet une étude plus précise de la ré-épithélialisation; 19 7). Les lapins sont généralement timides et non agressive. Anesthésiques ne sont nécessaires que pendant la chirurgie blessure. Cela peut réduire les facteurs de confusion potentiels qui peuvent affecter les processus de cicatrisation de la plaie, 8). Il est également veréconomique y parce que, jusqu'à 8 blessures peuvent être réalisés dans un lapin. 9). Contrairement à certains rapports précédents, nous n'avons pas vu toute la formation de cicatrices hypertrophiques soit dans les lapins non-diabétiques ou diabétiques observés pendant plus de 24 mois après la chirurgie. Le mécanisme n'est pas encore clair.

Plusieurs approches peuvent être prises pour modifier le fonctionnement pour répondre aux exigences d'essai différentes. 1). Autre prolongation de la période d'ischémie. Nos résultats actuels montrent que la différence de température la peau est maintenue au moins un mois. Si un matériau inerte (tel que le silicone) est utilisée pour remplir le tunnel, pour retarder la formation de vaisseaux collatéraux, le temps d'ischémie pourrait être étendu. Nous avons essayé cette technique dans certains lapins et j'ai trouvé très peu de réaction tissulaire; 2). Dénervation totale oreille. Notre technique de coupe des nerfs dans les deux pédicules vasculaires (centrale et du crâne), en laissant la branche caudale intacte. Si la dénervation totale de la plaie est nécessaire, la branche du nerf dans le pédicule caudal peut également être rompu que nousll; 3). Si l'inoculation bactérienne plaie est nécessaire, il peut être appliqué sur la plaie. Parce que la base de la plaie est cartilage de l'oreille, il a le potentiel pour obtenir l'infection et la perforation. Pour prévenir les complications du cartilage, l'inoculation bactérienne doit être appliqué après le cartilage est couvert par un tissu de granulation. Il convient de noter que la contamination bactérienne se fait facilement et il peut prolonger de manière significative le temps de guérison. Toutefois, l'établissement d'un biofilm dans les plaies aiguës est plus difficile. Utilisation de matériel clinique et l'état de l'art-technologie, biofilm a été montré pour être mis en place dans seulement 6% des plaies aiguës, tandis que dans les plaies chroniques, l'incidence est dix fois plus élevé (60%); 20 Notre expérience a montré que lorsque fois diabétiques atteindre deux ans, la plupart des blessures à l'oreille ischémique peut être infecté même avec une technique aseptique stricte. 4). Les ulcères de pression se produisent souvent chez les patients atteints de lésions nerveuses centrales ou périphériques en raison de la perte de sensation. En utilisant ce modèle, un pressuulcère de re peuvent également être créés par des méthodes de compression différents. 21,22

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Disclosures

Il n'ya pas de conflit d'intérêts financiers impliqués dans cette étude.

Acknowledgments

Cette étude a été financée en partie par des subventions du NIH et 1RO1DK74566 1RO1AM52984. Les auteurs tiennent à remercier Mme Jacqueline McCarty dans CRR pour son aide lors de la chirurgie, les Drs. Jianpu Wang et Harshini Sarojini pour leur aide dans les soins de chirurgie et post-opératoire de certains lapins, le Dr Rong Wan pour son travail histologie, et Mme Ming Li pour ses mesures de HPLC de phosphates à haute énergie.

Materials

For monitoring during surgery
  1. A heating pad to maintain normal temperature.
  2. A transcutaneous oxygen monitor.
  3. A temperature monitor.

For surgery
  1. A #3 knife with #15 blade.
  2. Two pairs of forceps (one for skin and another for other soft tissues).
  3. 2-3 pairs of small clamps.
  4. One or two pairs of micro scissors (for tissue cutting).
  5. One pair of small scissors (for cutting sutures).
  6. A needle holder.
  7. A few stainless steel punches (for making wounds).

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References

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