En Forenklet teknikk for produksjon av en iskemisk sår modell

Summary

Vi har utviklet en minimalt invasiv teknikk for å skape en kanin iskemisk øret såret modell ved å dele den sentrale arterie og nerve, og kraniale nevrovaskulære bunten. En subkutan tunnel kutter så alle subkutane vev. Denne prosedyren fører til minimal hud avbrudd og kan trygt brukes i diabetiske dyr.

Abstract

En stor hindring i dagens diabetiker såret forskning er en mangel på en iskemisk sår modell som trygt kan brukes i diabetiske dyr. Legemidler som fungerer godt i ikke-iskemiske sår kan ikke fungere i menneskelige diabetiske sår fordi vaskulopati er en viktig faktor som hindrer helbredelse av disse sårene. Vi publiserte en artikkel i 2007 beskriver en kanin øret iskemiske sår modell skapt av en minimal invasiv kirurgisk teknikk. Siden da har vi ytterligere forenklet prosedyre for enklere bruk. På det ene øret, ble tre små huden incisions gjort på de vaskulære pedicles, 1-2 cm fra øret base. Den sentrale arterie ble ligated og kuttet sammen med nerve. Hele kranial bundle ble kuttet og ligated, slik at bare kaudal grenen intakt. En omkrets subkutan tunnel ble gjort gjennom snittene, å kutte subkutane vev, muskler, nerver, og små fartøy. Den andre øret ble brukt som en ikke-iskemisk kontroll. Fire sår ble gjort på ventrale siden of hvert øre. Denne teknikken gir 4 iskemiske sår og 4 ikke-iskemiske sår i en dyr for parede sammenlikninger. Etter operasjonen var iskemisk øret kjølig og cyanotisk, og viste redusert bevegelse og manglende puls i øret arterien. Hudtemperatur av iskemisk øret var 1-10 ° C lavere enn på normale øret og denne forskjellen ble opprettholdt i mer enn én måned. Ear vev høyenergi fosfat innholdet var lavere i iskemisk øret enn kontroll øret. Sårheling ganger var lengre i iskemiske øret enn i ikke-iskemisk øret når samme behandling ble brukt. Teknikken har nå blitt brukt på mer enn 80 kaniner der 23 var diabetiker (diabetes tid spenner fra 2 uker til 2 år). Ingen enkelt kanin har utviklet noen kirurgiske komplikasjoner som blødning, infeksjon, eller brudd i huden snittene. Modellen har mange fordeler, for eksempel lite hud forstyrrelser, lengre iskemisk tid, og høyere suksessrate, sammenlignet med mange andre modeller. Det can trygt brukes i dyr med redusert motstand, og kan også bli modifisert for å møte ulike testkrav.

Protocol

1. Anatomisk Basis

Kaninen øret har vært et yndet studie materiale for sårbehandling siden tidlig ^20. århundre. Øret leveres med tre vaskulære bunter (sentral, kranial og kaudal), den sentrale bunt er den største, mens fartøy i kranie og kaudale bunter varierer i størrelse. Noen ganger kan kaudal arterien være fraværende. ¹ Alle disse skipene er lett gjenkjennelig på dorsal side etter øret er barbert (Fig. 1). På ventrale siden, ikke distale huden ikke får blodtilførsel fra proksimale fartøyene. De tre fartøy bunter på dorsal øret har mange grener som penetrerer gjennom brusken for å gi blodtilførsel til distale ventrale huden (Fig. 2). I noen kaniner, oppstår en svært liten subkutan fartøy også på ventrale side, som leverer blod til ikke mer enn 1/3 av ventrale huden. I en åpen omkrets hud snitt, det er essentially ingen blødning fra en ventral snitt.

2. Kirurgisk prosedyre

1. Kaninen er veid og ørene er barbert, sammen med baksiden av halsen.
2. En premedisinering av buprenorfin (0,01 mg / kg) gis IM en time før operasjonen.
3. Anestesi er indusert av en blanding av ketamin (50 mg / kg) og xylazin (5 mg / kg) IM.
4. Kaninen er beskyttet med en varmepute under operasjonen, blir øynene beskyttet med salve, og dens vitale tegn overvåkes under operasjonen.
5. Den kirurgiske feltet er utarbeidet aseptisk med en kirurgisk kratt og drapert slik at de to ørene utsettes.
6. Ett øre gjengis iskemisk, mens det andre øret fungerer som en sammenkoblet non-iskemisk kontroll.
7. De tre vaskulære pedicles er identifisert av arterier og vener.
8. Bruke en 15 blad, er tre små vertikale snitt (1-1,5 cm) gjort på de vaskulære pedicles, ca 1-2 cm fra øret base.
9. Den sentrale vene erisolert fra omkringliggende vev, og en sutur brukes til å omringe den for dementi. Den sentrale arterie er ligated med 4-0 suturer og delt.
10. Den medfølgende sentrale nerve er også kuttet.
11. Hele kranial pedicle er ligated og delt.
12. Den kaudal pedicle er bevart.
13. En subkutan tunnel er gjort gjennom de 3 snittene. Dette gjøres ved stump disseksjon med en klemme og skarpe disseksjoner med en kniv og saks. Alle de subkutane vev, muskler, nerver, og små vaskulære greiner er avviklet. De små vasculatures under dermis er helt delt. Alle subkutane vev er kuttet til nivået av brusk med bladet.
14. Videre skarpe og butte disseksjoner brukes til å rydde opp i basen, og etterlater et nakent brusk ca 5-10 mm bred.
15. Denne prosedyren avbryter alle de underhudssykdommer vaskulære grenene for å hindre dem fra å raskt etablere collaterals.
16. Blødning erminimal. Hvis det er noen, er det enkelt kontrolleres ved gasbind komprimering, uten behov for electrocautery.
17. Huden i øret ikke bærer mye blodtilførsel og dermed ikke radert.
18. De 3 hud snittene blir stengt ved hjelp av 4-0 eller 5-0 sting, og dekket med steril kompress.
19. De prosedyren resulterer i 3 små huden snitt og pådrar seg mye mindre hudskader enn en åpen kirurgi.
20. Fire sirkulære full tykkelse sår på huden er opprettet på ventrale siden av hvert øre med en 6 mm rustfritt stål punch. Avstanden mellom de sårene er minst 20-30 mm. Huden inni punsj såret fjernes fra brusk. Den perichondrium er også fjernet, med hud eller separat. Basen som korning og helingen skjer er brusk, men brusken er ikke perforert (Fig. 3).
21. Når sårene på begge ørene er fullført, blir testing narkotika brukes på den ene siden av to sår mens kontrollgruppen stoffet er Applstudert til sårene på den andre siden. Okklusjonstape (Tegaderm, 3M) brukes til å dekke såret. Dette hindrer at sårene fra å bli revet.
22. Sårene nederst delen av øret normalt leges raskere enn de sår øverst i øret. For sårtilheling sammenligning studien, anbefales det å sammenligne de to sårene på den ene siden med de to sår på den andre siden, eller for å sammenligne topp og bunn sår separat.

3. Postoperativ Care

1. En Duragesic patch er festet til baksiden huden å frigjøre Fentanyl (25 mikrogram / time) for 2-3 dager for å redusere mulig smerte.
2. Kaninene er fri adgang til mat og drikke.
3. Bandasjeskift utføres daglig. De gamle dressinger er fjernet og sårene rengjøres med sterile bomullspinner. Digitale bilder er tatt for sammenligning. Nye dressinger er anvendt, og sårene dekkes igjen med Tegaderm. Ingen bedøvelse er nødvendig under dressing lmAnges.
4. Skin Temperaturen måles daglig på hver øre for sammenligning.
5. Ekstra øre blodsirkulasjonen kan måles med en transkutan oksygen spenning meter eller en laser Doppler flowmeter.
6. Stingene kan fjernes etter en uke.
7. For ikke-diabetiske dyr, de fleste av øret sårene vanligvis leges i løpet av 2-3 uker.

4. Potensielle Komplikasjoner og hvordan unngå dem

Denne minimalt invasive kirurgi er trygt og komplikasjoner er sjeldne. Bortsett fra en overgangsperiode postoperativ mild øre ødem, ingen av våre kaniner har hatt noen alvorlige kirurgiske komplikasjoner. Likevel er det flere mulige komplikasjoner for denne prosedyren:

1. Blødninger. Blødninger kan oppstå i snittene hvis hemostase er ufullstendig eller dersom en større blodkar (som en av de viktigste pedicle fartøy) er skadet. Dette er enkelt unngås ved forsiktig disseksjon. I tillegg til de tre store vaskulære bunter der!re mange mindre underhud vaskulære grener. Når subkutan tunnel er gjort, er disse fartøyene blir kuttet, men ingen tying er nødvendig. Hemostase kan oppnås bare ved å trykke gasbind. Dette gjøres enkelt ved å sette et hjørne av gasbind i tunnelen for noen få minutter. Før du lukker snittet, sørge for at ingen aktiv blødning er til stede.
2. Snitt infeksjon og Spaltedannelse: Disse komplikasjoner kan oppstå hvis snittene blir forurenset. Dette kan unngås ved bruk av strenge aseptisk teknikk og ingen antibiotika er nødvendig. Men hvis infeksjonen skjer, hensiktsmessig drenering og bandasjeskift trengs.
3. Ear ødem: På grunn av vaskulære ligations og driftsavbrudd av lymfe sirkulasjonen, kan mild øre ødem presentere noen dager. Men forsvinner den av seg selv og ingen behandling er nødvendig.

5. Representative Resultater

Siden 2007 har vi brukt denne prosedyren i mer enn 70 kaniner, inkludert 23 diabetiker enimals. I diabetiker gruppen, ble operasjonen utført ved forskjellige diabetiske tider: sju kaniner hadde to uker på diabetisk tid, fire av dem hadde to måneder, ti hadde 12 måneder, og 2 hadde 24 måneder på diabetisk tid.

Umiddelbart etter operasjonen, dukket iskemisk øret kjølig og cyanotisk, med mild ødem. Den viktigste øre arterie-sentral arterie-hadde en sterk puls i normal øret, men denne pulsen var ikke til stede i iskemisk øret. Ear bevegelsen ble redusert, men ikke helt borte. Huden viste klare forsenkninger over tunnelen, men ingen iskemi eller nekrose ble funnet i alle slags dyr (Fig. 4).

Huden temperaturer på normal og iskemisk ørene ble målt med et digitalt termometer (Omron av Omron Healthcare, Bannockburn, IL, eller en type K infrarøde flekk termometer av Fisher Scientific, Pittsburgh, PA). De temperaturforskjeller mellom ikke-iskemisk og iskemisk øre varierte 1-10 ° C, Wed fleste kaniner som faller innenfor området 2-6 ° C. Fig. 5 viser gjennomsnittlig temperaturforskjeller fra 30 kaniner. Temperaturen Forskjellen var høyere i de tidlige dagene etter operasjonen, nedsettes gradvis etter dag 15, men ble likevel opprettholdt på slutten av en måned.

Tissue høyenergi fosfat innholdet ble målt hos noen dyr etter at de ble ofret. Seks vevsprøver ble tatt fra hvert øre og høyenergi fosfat innholdet ble målt ved HPLC. Både ATP og total energi konsentrasjoner var høyere i de normale ører enn i de iskemiske ørene. Fig. 6 viser et eksempel på en kanin ofret 23 dager etter operasjonen. De gjennomsnittlige vev ATP innholdet var 0,349 ± 0,047 mikromol / g (gjennomsnitt ± SD) i normal øret vs 0,237 ± 0,059 mikromol / g i iskemisk øret (p <0,005). Mean total energi (ATP + ADP + AMP) var 0,882 ± 0,137 mikromol / g i normal øret vs 0,556 ± 0,115 mikromol / g i ische mic øret (p <0,001).

Sårheling ganger var alltid lengre tid for iskemisk øret enn for ikke-iskemisk øre i alle grupper (ikke-diabetiker eller diabetiker). Fig. 7 viser en sammenligning av healing mellom 26 par sår på iskemisk og ikke-iskemisk ører. Healing ganger varierte fra 13 til 18 dager (gjennomsnittlig 14,9 ± 1,6 dager) på de normale ørene kontra 17 til 27 dager (gjennomsnittlig 20,5 ± 3.4 dager) på de iskemiske ørene (p = 0,001). Sårheling ganger i eldre og diabetikere kaniner var mye lengre, spesielt når diabetiker tiden var mer enn 12 måneder.

I disse kaniner, er alle snittene helbredet normalt uten komplikasjoner, inkludert kaniner med 24 måneders diabetiker tid. Figur 8 en histologi prøve som viser helbredet subkutan tunnel der muskelen er fraværende, og er erstattet av fibrøs vev. Imidlertid er huden intakt.

/ 3341fig1.jpg "/>
Figur 1. Kaninen øret leveres med tre vaskulære bunter. Det sentrale er den største, er den kraniale mindre, og på bakre del av bunt er den minste. Disse fartøyene er godt synlig på overflaten etter øret er barbert.

Figur 2. De tre fartøy bunter på dorsal øret leverer blod ikke bare til dorsal huden, men også til ventrale huden gjennom gjennomtrengende fartøy. Pilen viser gjennomtrengende fartøyene gjennom brusken. De innfelte viser tverrsnittene på disse fartøyene.

Figur 3. Fire 6 mm-sår er opprettet på ventrale siden av øret, og perichondrium er også fjernet. Basen som korning og helingen skjer er brusk, men brusken er ikke perforert. Det 3 smal l hud snittene blir stengt med svært lite hud avbrudd.

Figur 4. Etter at huden snittene er stengt, blir innrykk over subkutan tunnel tydeleg.

Figur 5. Den gjennomsnittlige hudtemperatur forskjell mellom normal og iskemisk øre i 30 kaniner. De tidlige forskjellen varierer fra 7 ° C til 10 ° C etter operasjonen. Forskjellen avtar gradvis, men likevel opprettholdt ved utgangen av en måned.

Figur 6. Ear vev med høy energi fosfat innholdet reduseres i iskemisk øret sammenlignet med ikke-iskemisk øre til 23 dager etter operasjonen (p <0,001).

41/3341fig7.jpg "/>
Figur 7. Sårtilheling tid er lenger i iskemiske ørene enn de ikke-iskemiske ørene (26 sår hver). Healing er definert som restaurering av integritet til skadet vev, dvs. hele reepithelialization av sår nettsteder.

Figur 8. Histologi prøven viser øret delen inneholder subkutan tunnel. Den grodd vev er tynnere enn normalt øre, er den opprinnelige skjelettmuskulatur fraværende og blir erstattet av fibrøs vev. Imidlertid er huden intakt.

Discussion

Diabetes påvirker 23,6 millioner mennesker i USA, ^2,3 og 15-20% av disse pasientene utvikler fotsår i sin levetid, ^4,5 på en årlig behandling kostnad på mer enn $ 25 milliarder kroner. ^3,6 Men selv de beste tilgjengelige behandlinger oppnå bare en 50% healing rate og dette er ofte midlertidig, ⁷ med tilbakefall priser så høyt som 66% hos diabetikere. ^3,6 Når sår oppstår hos diabetespasienter, store komplikasjoner som infeksjon og amputasjon øker dramatisk. Til tross for nesten et århundre med omfattende forskning og utvikling av tusenvis av dressing produkter, har ingen ennå vist seg effektiv. Uttalelsen om at "Gamle sår i 1830 vil være de eldre sår i 1860," laget i en av de første avisene beskriver kronisk sårbehandling, gjelder fortsatt i dag. ⁸ Finne en passende dyremodell for såret studien har vært en stor utfordring for forskere som vel som for klinikere. Mange dyremodeller har blitt oppretteteller foreslått for sårbehandling studie, men et sår modell sammenlignes med en kronisk, ikke-healing menneske sår er ikke-eksisterende. ^9,10 Dette er fordi alle menneskelige diabetiske sår har en kombinasjon av vev iskemi, kronisk hyperglykemi, oksidativt stress, nevropati, og bakteriell kolonisering. Iskemi kan ikke være den tidligste årsaken diabetiske fotsår, men det er den viktigste årsaken til utholdenhet av disse sårene, ^11. Dette er fordi sårene ikke leges i vev som ikke blør ikke, mens de nesten alltid leges i vev som blør mye. ^12-15 Dessverre har ingen av de nåværende brukte animalske iskemiske sår modeller blitt brukt med hell i diabetiske dyr, og dette har skapt et stort hinder for testing av sår narkotika. Småskala kliniske studier av vekstfaktorer, som bFGF, har vist dem til å være svært effektive, men de er ineffektive i hypoksisk dermale sår modeller. ^16,17

Vi publiserte en kunsticle i 2007 beskriver en iskemisk kanin øre sår modell som ble brukt med suksess i diabetiske dyr. ^18. Teknikken er litt vanskelig å utføre fordi en forsiktig disseksjon av den kraniale nevrovaskulære bunten er nødvendig. Fordi disse fartøyene er små, er deres bidrag til postoperativ utvinning ubetydelig. Siden da har vi forenklet prosedyren ved å skjære hele kraniale nevrovaskulære bunt. For å sammenligne med den prosedyre der den kraniale bunten ble bevart, var det ingen forskjell i sårheling eller øret komplikasjoner. Dette endret minimalt inngrep har følgende fordeler: 1). Det er enkelt, trygt, og har en høy suksessrate, som reduserer smerte og lidelse for dyrene. Ingen kirurgisk komplikasjon har skjedd i disse dyrene, inkludert noen kaniner med 24 måneders diabetiker tid, 2). Den har en lang iskemisk tid. Våre målinger indikerte en hud temperatur forskjell i slutten av en måned. Det er mulig at the omfattende underhudssykdommer disseksjon uten å kreve suturing vevet tilbake resultatene i forsinket sivile formasjon, 3). Det er veldig fleksibel. Fordi de tre vaskulære buntene er alle under kirurgisk kontroll, kan denne modellen enkelt gjøres for å etterligne ulike kroniske sår (se nedenfor), 4). I motsetning til huden andre steder, disse sårene har ingen hårsekker i såret. Den helbredende er helt fra såret kant, 5). Denne prosedyren skaper 4 iskemiske sår og 4 ikke-iskemiske sår i samme kanin for parede sammenligning, og dermed redusere individuelle variasjoner, 6). Skin sammentrekning er minimal. Mens dorsal huden av kanin øret har noen mobilitet, er det ventrale huden splinted av brusk, slik at mer nøyaktig studie av re-epithelialization, ¹⁹ 7). Kaniner er generelt engstelig og nonaggressive. Bedøvelse er nødvendig bare under såret kirurgi. Dette kan redusere eventuelle konfunderende faktorer som kan påvirke sårheling prosesser, 8). Det er også very økonomisk fordi opptil 8 sår kan gjøres på en kanin. 9). I motsetning til enkelte tidligere rapporter har vi ikke sett noen hypertrofisk arrdannelse i enten uten diabetes eller diabetisk kaniner observert i mer enn 24 måneder etter operasjonen. Mekanismen er fortsatt uklart.

Flere tilnærminger kan tas for å endre driften for å møte ulike testkrav. 1). Ytterligere forlengelse av iskemisk tid. Våre nåværende resultater viser at huden temperaturforskjellen opprettholdes minst en måned. Hvis noen inert materiale (for eksempel silikon) brukes til å fylle tunnelen, å utsette pantet formasjonen, kan iskemisk tid bli utvidet. Vi prøvde denne teknikken i noen kaniner og fant svært lite vev reaksjon, 2). Totalt øre denervering. Vår teknikk kutter nervene i de to vaskulære pedicles (sentral og skallen), forlater kaudal grenen intakt. Hvis total såret denervering er nødvendig, kan det nerve grenen i kaudal pedicle også bli brutt som vill, 3). Hvis såret bakteriell inokulasjon er nødvendig, kan det brukes på såret. Fordi bunnen av såret er øret brusk, har det potensial til å få infeksjon og perforering. For å hindre brusk komplikasjoner, bør bakteriell inokulasjon påføres etter at brusken er dekket av granulasjonsvev. Det bør bemerkes at bakteriell forurensning er lett gjort, og det i betydelig grad kan forlenge den helbredende tid. Imidlertid er etablering av biofilm i akutte sår vanskeligere. Ved hjelp av klinisk materiale og state-of-the-art teknologi, har biofilm vist seg å være etablert i bare 6% av akutte sår, mens i kroniske sår forekomsten er ti ganger høyere (60%), ²⁰ Vår erfaring har vist at når diabetiske ganger nå to år, kan de fleste sår på iskemisk øret bli smittet selv med streng aseptisk teknikk. 4). Trykksår forekommer ofte hos pasienter med sentrale eller perifere nerveskader som følge av tap av følelse. Ved hjelp av denne modellen, en pressure sår kan også skapes ved ulike komprimeringsmetoder. ^21,22

Materials

For monitoring during surgery

A heating pad to maintain normal temperature. A transcutaneous oxygen monitor. A temperature monitor.

For surgery

A #3 knife with #15 blade. Two pairs of forceps (one for skin and another for other soft tissues). 2-3 pairs of small clamps. One or two pairs of micro scissors (for tissue cutting). One pair of small scissors (for cutting sutures). A needle holder. A few stainless steel punches (for making wounds).