Nós fornecemos um guia prático para entregar traçadores In vivo E usar a via espinocerebelar como um sistema modelo para demonstrar passos essenciais para a análise do circuito neuronal sucesso em camundongos. Descrevemos em detalhe o nosso protocolo versátil rastreamento que explora aglutinina de gérmen de trigo (WGA), conjugada com fluoróforos Alexa.
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Artigo de método
Revelando Topografia Circuito Neural em Multi-Color
Neste artigo
Resumo
Resumo
Circuitos neurais funcionais estão organizados em mapas topográficos. Para visualizar a arquitetura circuito complexo que nós desenvolvemos uma abordagem para a fiabilidade rótulo o padrão global de múltiplas projeções topográficos. O cerebelo é um modelo ideal para estudar o arranjo ordenado dos circuitos neurais. Por exemplo, a organização compartimental de espinocerebelar fibras musgosas provou ser um sistema indispensável para o estudo de padronização de fibras musgosas. Recentemente, mostrou que aglutinina de gérmen de trigo (WGA), conjugada com Alexa 555 e 488 podem ser usados para rastreamento espinocerebelar projeções de fibras musgosas no desenvolvimento e camundongos adultos (Reeber et al. 2011). Encontramos três principais propriedades que tornam as ferramentas WGA-Alexa traçadores desejável para rotulagem projeções neural. Primeiro, fluoróforos Alexa são intensas e seu brilho permite imagens wholemount diretamente após rastreamento. Segundo, WGA-Alexa traçadores rótulo toda a trajetória de desenvolvimento neural e adultos Projections. Terceiro, WGA-Alexa traçadores são rapidamente transportados nas direções retrógrada e anterógrada. Aqui, descrevemos em detalhes como preparar os marcadores e outras ferramentas necessárias, como executar a cirurgia para rastreamento espinocerebelar ea melhor forma de projeções de imagem traçada em três dimensões. Em resumo, nós fornecemos um protocolo passo a passo de rastreamento que vai ser útil para decifrar a organização e conectividade de mapas funcionais não só no cerebelo, mas também no córtex, tronco cerebral e medula espinhal.
Protocolo
1. Entregar tracers in vivo utilizando a cirurgia estéril (Seções 1,1-1,16)
Durante todo o processo, aconselhamos que o padrão estéril técnicas cirúrgicas ser usado. Isso inclui o uso de luvas estéreis, vestido, e máscara. Ferramentas devem ser tanto autoclavado antes da utilização ou limpos cuidadosamente com água e então etanol. Durante a cirurgia, e especialmente entre os animais, fragmentos de tecido limpar as ferramentas e secar esterilizar instrumentos com um hot talão esterilizador (Steri Cat 250. # 18000-45, Ferramentas Ciência Fine). Além disso, é fundamental que você a organizar seu espaço de trabalho de tal forma que voc....
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Discussão
Nós descrevemos os detalhes cirúrgicos e técnicos necessários para o sucesso rastreamento axonal e dendrite usando uma abordagem baseada em romance fluorescentes para rapidamente rotulagem projeções neurais no desenvolvimento e camundongos adultos. Utilizando-WGA Alexa mostramos como traçadores e marcadores podem ser usados para analisar padrões topografia de circuito em alta resolução e em três dimensões.
Traçadores muitos estão disponíveis para rastrear circuitos neuronais incluindo cóle.......
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Divulgações
Não há conflitos de interesse declarados.
Agradecimentos
Este trabalho foi financiado pelo investigador novas start-up fundos de Albert Einstein College of Medicine da Yeshiva University de RVS.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Equipamento / reagentes | Modelo / número Catálogo | Companhia | |
| Bead esterilizador | Modelo Steri 250 Cat. # 18000-45 | Multa Ferramentas Ciência | |
| Cauterizador | Gato. # 18000-00 | Multa Ferramentas Ciência | |
| Vidro borosilicato capilares | Gato. # 300056 | Harvard Apparatus | |
| Vidro duplo estágio Micropipeta Puller | Modelo PC-001-10 | Narishige | |
| Seringa micrométrica | Gato. # GS-1100 | Gilmont Instruments | |
| Instrumento estereotáxica Pequenos Animais | Modelo 940-A | Instrumentação Kopf | |
| Manipulator eletrodo | Modelo 960 | Instrumentação Kopf | |
| Vetcare câmara | Gato. #340508 | Harvard Apparatus | |
| Almofada de aquecimento | Gato. # 341241 | Harvard Apparatus | |
| Leica DFC360 FX câmera | DFC360 FX | Leica | |
| Leica câmera DFC490 | DFC490 | Leica | |
| Leica DM5500 microscópio | DM5500 | Leica | |
| Leica DFC3000 FX câmera | DFC3000 FX | Leica | |
| Leica MZ16 FA microscópio | MZ16 FA | Leica | |
| Cy3 Filtro | Modelo # 11600231 | Leica | |
| FITC Filtro | Modelo # 11513880 | Leica | |
| A4 DAPI / filtro UV | Modelo # 11504162 | Leica | |
| Aglutinina de gérmen de trigo, Alexa Fluor 488 conjugado | Gato. # W11261 | Invitrogen | |
| Trigo germ aglutinina, Alexa Fluor 555 conjugado | Gato. # W32464 | Invitrogen |
Referências
- Apps, R., Hawkes, R. Cerebellar cortical organization: a one-map hypothesis. Nat. Rev. Neurosci. 10, 670-681 (2009).
- Grishkat, H. L., Eisenman, L. M. Development of the spinocerebellar projection in the prenatal mouse. J. Comp. Neurol. 363, 93-108 (1995).....
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Reimpressões e permissões
