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Artigo de método

Em desencapsulamento vitro do HIV-1 Cores

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DOI:

10.3791/3384

⸱

8 de novembro de 2011

 , 
1Department of Pathology, Microbiology and Immunology, Vanderbilt University School of Medicine

Neste artigo

Resumo

Desencapsulamento é um passo essencial na fase inicial do ciclo de vida do HIV-1 e é definido como a desmontagem do shell capsídeo ea liberação do complexo de ribonucleoproteína viral (vRNP). Aqui, nós demonstrar técnicas para isolar núcleos intactos de HIV-1 virions e para quantificar a sua desencapsulamento In vitro.

Resumo

O genoma do retrovírus é envolto em um capsídeo cercada por um envelope lipídico. Para lentivírus, como o HIV-1, o shell do capsídeo cônica é composto de proteína CA organizados como uma rede de hexágono. O capsídeo é fechada por sete pentamers no final largo e 5 na parte mais estreita do cone 1, 2. Encerradas nesta shell capsídeo é o complexo ribonucleoproteína viral, e juntos eles compõem o núcleo.

Após a fusão da membrana viral com a membrana da célula-alvo, o HIV-1 é liberada no citoplasma. O capsídeo, em seguida, liberando desmonta CA livre na forma solúvel 3 em um processo conhecido como desencapsulamento. A localização intracelular eo calendário de HIV-1 desencapsulamento são mal compreendidos. Único amino-ácido substituições em CA que alteram a estabilidade do capsídeo também prejudicar a capacidade do HIV-1 para infectar as células 4. Isso indica que a estabilidade do capsídeo é crítico para infecção VIH-1. HIV-1 desencapsulamento tem sido difícil de estudar por falta de disponibilidade de ensaios sensíveis e confiáveis ​​para este processo. Aqui nós descrevemos um método quantitativo para o estudo in vitro utilizando desencapsulamento núcleos isolados de HIV-1 infecciosas partículas. A abordagem envolve o isolamento de núcleos por sedimentação de partículas virais concentradas através de uma camada de detergente e em um gradiente de sacarose linear, no frio. Para quantificar desencapsulamento, os núcleos isolados são incubados a 37 ° C para vários intervalos de tempo e posteriormente peletizadas por ultracentrifugação. A extensão da desencapsulamento é analisada pela quantificação da fração do CA no sobrenadante. Esta abordagem tem sido empregada para analisar os efeitos das mutações virais do HIV-1 estabilidade capsídeo 4, 5, 6. Deve também ser útil para estudar o papel dos fatores celulares em HIV-1 desencapsulamento.

Protocolo

1. Produção de partículas de HIV-1

Antes de prosseguir, você deve obter a permissão e siga as orientações do escritório de Biossegurança da sua instituição para trabalhar em uma instalação de biossegurança aprovado para HIV infecciosas. Você deve garantir que a atenção adequada e precauções de segurança são seguidas durante a trabalhar no laboratório de biossegurança.

Produção de partículas de HIV-1 é normalmente realizada por transfecção transiente de células 293T com HIV-1 DNA proviral utilizando um método de transfecção de fosfato de cálcio 7, 8. Estoques altos títulos de vírus cresceu em cultura de células T infectadas também são adequados.

  1. Cultura 293T células Modified Dulbecco Eagle Medium (DMEM) contendo 10% de soro fetal bovino (FBS) e suplementadas com antibióticos [penicilina (100 UI / ml) e estreptomicina (100 mg / ml)], a 37 ° C CO, 5% 2 .
  2. Separar células de pratos quase confluentes com 0,25% tripsina-EDTA e sementes de 2x10 6
  3. No dia seguinte, a monocamadas de células deve ser de cerca de 25% confluentes e pronto para transfecção. Por seis pratos de células a serem transfectadas, trazer 120 mg de DNA proviral até um volume de 2,7 ml com água estéril. Para esta mistura adicione 0,3 ml de 2,5 M CaCl 2 e 3 ml de 2XBBS, e misture bem por pipetagem cima e para baixo várias vezes. Deixe a mistura descansar em temperatura ambiente por 10-20 minutos.
  4. Adicionar 1 ml da mistura resultante gotas para o centro de cada prato enquanto agita suavemente para misturar. Coloque os pratos durante a noite (~ 16 horas) em um conjunto de incubadora a 35 ° C e 3% CO 2.
  5. Aspirar o meio de cultura e gentilmente adicionar 5 ml de PBS.
  6. Aspirar PBS e adicionar 5 ml de meio fresco. Cultura das células na incubadora a 37 edeg; C e 5% de CO 2 para adicional de 24-48 horas.
  7. Recolher o sobrenadante de cultura contendo partículas virais, transferi-lo para um tubo de centrífuga 50 ml. Combine os sobrenadantes de todos os pratos e centrifugar a 1.500 xg por 5 min para as células pellet e detritos. Filtrar o sobrenadante usando 0,45 mM filtros de poros de tamanho da seringa. Devem ser tomadas precauções para minimizar a formação de aerossóis durante o trabalho com o vírus vivo. Isso inclui o uso de tubos cônicos com O-rings ou tampas balde rotor durante a etapa de centrifugação. Se isso não for possível, as tampas dos tubos deve ser envolvido com parafilme.

2. Concentração de HIV-1 virions por ultracentrifugação

  1. Coloque o sobrenadante da cultura (30 ml) em um tubo de centrífuga 38,5 ml polyallomer (para rotor Beckman SW32Ti ou equivalente). Suavemente underlay o sobrenadante contendo vírus com 5 ml de solução de sacarose 20% em PBS usando uma pipeta de 5 ml.
  2. Centrifugar por 3 horas a32.000 rpm a 4 ° C (175.000 xg em r max) de partículas do vírus da pelota.
  3. Retire o sobrenadante por aspiração, tomando cuidado para não perturbar o pellet no fundo do tubo. Adicionar 0,5 ml de tampão 1XSTE (10 mM Tris-HCl [pH 7,4], 100 mM NaCl, 1 mM EDTA) para o tubo e colocar a 4 ° C por 1 hora para soltar o pellet. Usando um wide-bore uma ponta da pipeta pipeta suavemente ml cima e para baixo algumas vezes para retirar o sedimento do fundo do tubo. Em seguida, transferir o pellet afrouxou a um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, tendo o cuidado de evitar a formação de espuma. Incubar a 4 ° C por mais de 1-3 horas para permitir que os pequenos aglomerados de vírus para dispersar. Durante esse período, prepare o gradiente de sacarose como descrito no passo 3.1.
  4. Pipeta suavemente a suspensão de vírus para cima e para baixo várias vezes e centrifugar a 8.000 rpm (6.000 xg) a 4 ° C em microcentrífuga refrigerada por 1 min para remover aglomerados residual. Manter o frio da amostra durante este processo.

3. Gradiente de sacarosecentrifugação para isolar núcleos

HIV-1 núcleos estão isolados utilizando um "spin-thru" método 9, que é uma modificação do método descrito anteriormente para a purificação de HIV-2 núcleos 10.

  1. Prepare um gradiente de sacarose 12 ml linear de 30% a 70% em tampão 1XSTE em um tubo de centrífuga 14,5 ml polyallomer para SW32.1Ti rotor. Para preparar gradiente, use um gradiente de 20 ml anterior; lugar 6 ml da solução de sacarose 70% no lado mais próximo (perto da porta de saída) e 6 ml da solução de sacarose 30% do outro lado. Certifique-se que as bolhas de ar não são presos no canal que liga as duas câmaras. Use o Auto gradiente DENSI Flow-ex para bombear o gradiente de baixo para cima do tubo contendo 1 ml da solução de sacarose 85% na parte inferior. Delicadamente, coloque o gradiente de temperatura de 4 ° C até refrigerado (2-4 horas).
  2. Usando um wide-bore uma ponta da pipeta ml suavemente o gradiente overlay com 0,25 ml da solução de sacarose 15% em STE contendo 1% Triton X-100.
    3. Suavemente sobreposição com 0,25 ml da solução de sacarose 7,5% em STE usando um wide-bore uma ponta da pipeta ml. Tenha cuidado para não misturar as camadas.
  3. Suavemente sobreposição com 0,5 ml de suspensão de vírus a partir do passo 2.4. Esta etapa deve ser realizada com cuidado para evitar qualquer perturbação no gradiente e mistura das camadas de sacarose underlaid.
  4. Coloque os tubos no balde SW32.1Ti pré-resfriado e centrifugar a 32.000 rpm (187.000 xg em r max) durante a noite (16-20 horas) a 4 ° C. Para evitar a pausa da centrífuga, não comece a centrifugação até o vácuo na centrífuga chega a 250 mM
  5. Colete 1 ml frações de cima para baixo do gradiente usando o gradiente de fraccionamento da Auto-DENSI-Flow. Coloque os tubos em gelo imediatamente após a coleta. Misturar o conteúdo dos tubos por inversão várias vezes, e retirar 50 ul de cada fração para a quantificação por ELISA ou ensaio de atividade da transcriptase reversa.

4. Localização de núcleos de HIV-1e armazenamento de núcleos

  1. Antes de realizar ensaios desencapsulamento, é importante para determinar quais frações contêm intacta HIV-1 núcleos. Isto pode ser determinado por ELISA p24 ou ensaio de atividade da transcriptase reversa usando os 50 mL alíquotas a partir do passo 3.6.
  2. A recuperação da CA associado com os núcleos é muitas vezes relacionada com a estabilidade dos núcleos. Medir o núcleo associado CA por ELISA p24 9, utilizando uma amostra de cada fração. Alternativamente, medir a atividade da transcriptase reversa de cada fração. Usando ambos os métodos o pico deve ser em torno fração 10.
  3. Piscina as frações contendo núcleos. Se os núcleos não devem ser usadas para desencapsulamento ensaio imediatamente, alíquota dos núcleos reunidos em 0,2-0,3 ml alíquotas, flash freeze-em N2 líquido e armazenar a -80 ° C. Núcleos congelados desta forma são adequados para o ensaio desencapsulamento. O rendimento do CA-core é tipicamente associada 1-2 mcg por mililitro de p24 ou cerca de 15% do total virion-associadop24.

5. Ensaio de cinética de HIV-1 desencapsulamento

  1. A quantidade de HIV-1 núcleos necessária por reação desencapsulamento é de aproximadamente 50 ng. Para executar o ensaio in vitro desencapsulamento, Pré-diluir a alíquota de núcleos com um volume igual de tampão 1XSTE frio para reduzir a viscosidade da suspensão e para minimizar os erros de pipetagem.
  2. Diluir ainda mais 100 ul dos núcleos em 0,15 ml de tampão 1XSTE frio contendo 10 mg / ml de BSA em um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Nós complementar o tampão STE com BSA (10 mg / ml) para minimizar a adsorção do CA para as paredes do tubo. Misture por vezes invertendo o tubo várias. Não vortex as amostras. Incubar os tubos em banho-maria a 37 ° C por intervalos de tempo (15, 30, 60 e 120 min). Os tubos devem ser imersas em banho de água pelo menos até o nível da amostra interna a fim de garantir até mesmo o aquecimento.
  3. Durante a incubação, misture suavemente o conteúdo do tubo periodicamente (normalmente 5 -10 min) por um movimento súbito do tubo. Para um controle minuto zero, diluir 100 ml de núcleos em 0,15 ml de tampão 1XSTE frio e incubar no gelo por todo o comprimento do experimento (120 min). O controle minuto zero dá o valor desencapsulamento basal e é usado para determinar aumento de desencapsulamento de núcleos incubados a 37 ° C por diferentes intervalos de tempo.
  4. No final do período de incubação, parar o processo de desencapsulamento colocando os tubos em gelo durante 10 minutos.
  5. Centrifugar os tubos a 45.000 rpm (TLA-55 rotor; 125.000 xg em r max) por 20 minutos a 4 ° C. Isto pellet núcleos intactos e os CA livre liberado como resultado de desencapsulamento de núcleos permanecerão no sobrenadante. O rotor deve ser pré-resfriada a 4 ° C antes de carregar as amostras.
  6. Transfira o sobrenadante para novos tubos de microcentrífuga pré-resfriada de preferência usando gel-carregamento dicas armazenados em temperatura ambiente. Por favor, note que o pellet não será visível a olho nu, por isso tome cuidado extremo wnquanto pipetagem fora o sobrenadante. Volte a suspender as pellets em 250 mL de ELISA diluente de amostra (0,5% Triton X-100 e 5% dos doadores soro bovino em PBS). Para garantir a dissolução eficiente do pellet, vortex após adicionar o diluente de amostra ELISA. Quantificar o conteúdo de CA do pellet e sobrenadante usando ELISA p24 como descrito na seção seguinte.
  7. A extensão da desencapsulamento é obtido através do cálculo da fração de CA presentes no sobrenadante.

6. Ensaio para a CA por ELISA p24

  1. Muitos kits comerciais ELISA estão disponíveis e podem ser usados ​​para quantificar CA. Usar qualquer comercial ou "in-house" ELISA e incluem padrões p24 para determinar a linearidade do ensaio. Diluições das amostras devem ser testados para garantir a precisão.
  2. Temos desenvolvido um ELISA caseiros que usam rotineiramente para ensaio para CA. O procedimento é adaptado de um relatório anterior 11 e é realizada utilizando detector de captura e anticorpos disponível a partir de AID NIHS Programa de Pesquisa e de reagente de referência.

7. Resultados representativos:

Um exemplo de um resultado de ELISA para determinar frações contendo núcleo é mostrado na Figura 1. Após a coleta de frações (1 ml cada), 50 mL de amostra de cada fração foi usada para fazer diluições seriadas e analisados ​​por ELISA. O p24 total obtido somando os valores de doze frações foi de 14,5 mg. Como mostrado nas frações figura 8 a 10 núcleos contidos. O valor para as frações p24-core contendo 2,17 mg foi. A porcentagem de núcleos associados p24 (14,97%) foi determinado tendo a relação de valor para as frações p24 core (2,17 mg) para o valor total p24 (14,5 mg). Fração 1 ou 2 conterá sempre maior quantidade de p24, o que representa CA livre que não está associado com os núcleos. Isto é seguido por uma redução gradual nos valores de p24 com cada fração subseqüente, em seguida, um aumento acentuado e, finalmente, uma gota afiada no p24valores. Se é bom tomar cuidado ao carregar o gradiente, em seguida, o pico de core-associados da CA é encontrado em torno fração 10.

Um resultado típico obtido através do ensaio de cinética de desencapsulamento de HIV-1 núcleos é mostrado na Figura 2. O gráfico mostra um aumento tempo-dependente em desencapsulamento de tipo selvagem HIV-1 núcleos. O percentual desencapsulamento valor foi obtido através do cálculo da fração de CA presentes no sobrenadante. Com a prática, o ensaio é altamente reprodutível e é útil para determinar a estabilidade dos núcleos viral in vitro. Por favor, note que a reprodutibilidade do ensaio é altamente dependente do tratamento adequado das amostras durante o procedimento. Uma vez que os núcleos são instáveis ​​o calor, as amostras devem ser mantidas a 4 ° C durante todo o ensaio, exceto durante o período de incubação.

Figura 1
Figura 1 Equilibrium centrifugação em gradiente de densidade deHIV-1 núcleos. A suspensão de vírus concentrado foi aplicado para o topo de um gradiente de sacarose 30 a 70% linear coberta com 1% Triton-X-100. Após centrifugação durante a noite a 187.000 xg e 4 ° C, 1 ml foram coletadas frações de cima (Fração 1) para baixo (Fração 12) e p24 foi quantificada por ELISA.

Figura 2
Figura 2 curso Hora do HIV-1 desencapsulamento in vitro. Purificada HIV-1 núcleos foram diluídos e incubados a 37 ° C para os intervalos de tempo indicado. A amostra min zero foi incubado em gelo por todo o comprimento do experimento. Após a incubação, as amostras foram ultracentrifugadas em 125.000 xg por 20 minutos a 4 ° C. Sobrenadante e pelotas foram separados e analisados ​​por ELISA p24. A extensão da desencapsulamento foi determinada conforme descrito no texto do protocolo. Cada reação desencapsulamento foi realizada em duplicata; barras de erro abrange a gama dos dois valores.

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Discussão

O método descrito aqui para purificar HIV-1 núcleos para estudar desencapsulamento in vitro é útil para estudar esta fase do ciclo de vida do HIV-1, especialmente devido à indisponibilidade de um método validado para analisar HIV-1 desencapsulamento em células-alvo. Embora este método usa ultracentrifugação equilíbrio para purificar núcleos, outros autores utilizaram a peletização direta após lise breve com 1% Triton X-100-12, 13 ou peletização através de uma almofada de sacarose sobrepostas com 0,1% Triton <...

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Divulgações

Não há conflitos de interesse declarados.

Agradecimentos

HIV-1 desencapsulamento estudos em laboratório Aiken foram apoiados pelo NIH concede AI40364, AI50423 e AI076121. Vários materiais-chave, incluindo reagentes utilizados na ELISA p24, foram fornecidos pelo NIH AIDS Programa de Pesquisa e Referência, da Divisão de AIDS, NIAID, NIH.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Nome do reagente Companhia Número de catálogo Comments (opcional)
DMEM Cellgro 10-013-CV
PBS Cellgro 21-031-CV
Triton-X-100 Mallinckrodt Baker Inc 9002-93-1
Tween 20 Acros 9005-64-5
0,25% tripsina-EDTA Cellgro 25-053-CI
2XBBS Composição: 50mm BES [p H 6,95], 280 mM NaCl e 1,5 mM Na 2 HPO 4. Ajustar o pH a 6,95em temperatura ambiente. Filtro de esterilizar e armazenar em alíquotas a -20 ° C.
Anticorpo de revestimento: anticorpo monoclonal para p24 (183-H12-5C) NIH AIDS Research and Reference Programa Reagente 3537
Anticorpo primário: HIV-Ig (soro hiperimune paciente humano)

NIH AIDS Research

e Programa de reagente de referência 		3957

Anticorpo secundário:

Cabra anti-IgG humana, conjugado com peroxidase 		Perfurar 31130
Substrato HRP KPL Inc 50-76-11
Immulon 2HB 96 placas bem Thermo Scientific 3455
SW32Ti e rotores SW32.1 Ti e ultracentrífuga compatível Beckman Coulter
TLA-55 rotor e ultracentrífuga tabletop Beckman Coulter
Tubos de microcentrífuga de alta velocidade Beckman Coulter 326823, 358123, 357448
Auto DENSI-Flow de fraccionamento da gradiente de densidade Labconco Corp 4517000
O ex-gradiente CBS Scientific Co. Inc. GM-20

Referências

  1. Ganser, B. K., Li, S., Klishko, V. Y., Finch, J. T., Sundquist, W. I. Assembly and analysis of conical models for the HIV-1 core. Science. 283, 80-83 (1999).
  2. Li, S., Hill, C. P., Sundquist, W. I., Finch, J. T. Image reconstructions of helical assemblies of the HIV-1 CA protein. Nature. 407, 409-413 (2000).
  3. Aiken, C. Viral and cellular factors that regulate HIV-1 uncoating. Curr. Opin. HIV. AIDS. 1, 194-199 (2006).
  4. Forshey, B. M., Schwedler, U. von, Sundquist, W. I., Aiken, C. Formation of a human immunodeficiency virus type 1 core of optimal stability is crucial for viral replication. J. Virol. 76, 5667-5677 (2002).
  5. Forshey, B. M., Aiken, C. Disassembly of human immunodeficiency virus type 1 cores in vitro reveals association of Nef with the subviral ribonucleoprotein complex. J. Virol. 77, 4409-4414 (2003).
  6. Wacharapornin, P., Lauhakirti, D., Auewarakul, P. The effect of capsid mutations on HIV-1 uncoating. Virology. 358, 48-54 (2007).
  7. Chen, C., Okayama, H. High-efficiency transformation of mammalian cells by plasmid DNA. Mol Cell Biol. 7, 2745-2752 (1987).
  8. Aiken, C. Methods in Molecular Biology. Prasad, V. R., Ganjam, K. V. 485, 41-53 (2009).
  9. Kotov, A., Zhou, J., Flicker, P., Aiken, C. Association of Nef with the human immunodeficiency virus type 1 core. J. Virol. 73, 8824-8830 (1999).
  10. Kewalramani, V. N., Emerman, M. Vpx association with mature core structures of HIV-2. Virology. 218, 159-168 (1996).
  11. Wehrly, K., Chesebro, B. p24 antigen capture assay for quantification of human immunodeficiency virus using readily available inexpensive reagents. Methods. 12, 288-293 (1997).
  12. Welker, R., Hohenberg, H., Tessmer, U., Huckhagel, C., Kräusslich, H. G. Biochemical and structural analysis of isolated mature cores of human immunodeficiency virus type 1. J. Virol. 74, 1168-1177 (2000).
  13. Briggs, J. A., Wilk, T., Welker, R., Kräusslich, H. G., Fuller, S. D. Structural organization of authentic, mature HIV-1 virions and cores. EMBO J. 22, 1707-1715 (2003).
  14. Auewarakul, P., Wacharapornin, P., Srichatrapimuk, S., Chutipongtanate, S., Puthavathana, P. Uncoating of HIV-1 requires cellular activation. Virology. 337, 93-101 (2005).
  15. Accola, M. A., Ohagen, A., Göttlinger, H. G. Isolation of human immunodeficiency virus type 1 cores: retention of Vpr in the absence of p6(gag. J. Virol. 74, 6198-6202 (2000).

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Reimpressões e permissões

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