O órgão vomeronasal (VNO) detecta sinais químicos intraespecíficos que transmitem informações sociais e reprodutivas. Realizamos experimentos de imagem de Ca2+ utilizando camundongos transgênicos que expressam G-CaMP2 no tecido do VNO. Essa abordagem nos permite analisar os padrões complexos de resposta dos neurônios vomeronasais a um grande número de estímulos de feromônios.
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Artigo de método
Responses imagem Neuronal em Preparações Slice of Organ Vomeronasal Expressando um sensor de cálcio geneticamente codificado
Neste artigo
Resumo
Resumo
O órgão vomeronasal (OVN) detecta sinais quimiossensoriais que carregam informações sobre o status social, sexual e reprodutivo de indivíduos da mesma espécie 1,2. Esses sinais intraespécie, as feromônas, bem como sinais de alguns predadores 3, ativam os neurônios sensoriais vomeronasais (NSVs) com altos níveis de especificidade e sensibilidade 4. Pelo menos três famílias distintas de receptores acoplados à proteína G, V1R, V2R e FPR 5-14, são expressas nos neurônios do OVN para mediar a detecção dessas pistas quimiossensoriais. Para compreender como a informação feromonal é codificada pelo OVN, é fundamental analisar os perfis de resposta de NSVs individuais a diversos estímulos e identificar os receptores específicos que medeiam essas respostas.
Os neuroepitélios do Órgão Vomeronasal (VNO) estão envoltos por um par de ossos vomerianos. A estrutura tubular semi-cega do VNO possui uma extremidade aberta (o ducto vomeronasal) que se conecta à cavidade nasal. Os neurônios sensoriais vomeronasais (VSNs) estendem seus dendritos até a parte luminal do VNO, onde as pistas feromonais entram em contato com os receptores expressos nas terminações dendríticas. Os corpos celulares dos VSNs formam camadas pseudoestratificadas, com V1R e V2R expressos nas camadas apical e basal, respectivamente 6-8. Várias técnicas têm sido utilizadas para monitorar as respostas dos VSNs a estímulos sensoriais 4,12,15-19. Entre essas técnicas, a preparação de fatias agudas oferece diversas vantagens. Primeiro, em comparação com VSNs dissociados 3,17, as preparações em fatia mantêm os neurônios em sua morfologia nativa e os dendritos das células permanecem relativamente intactos. Segundo, os corpos celulares dos VSNs são facilmente acessíveis em fatias coronais do VNO, permitindo estudos de eletrofisiologia e experimentos de imagem, diferentemente das preparações de epitélio inteiro e em montagem inteira 12,20. Terceiro, este método pode ser combinado com técnicas de clonagem molecular para permitir a identificação de receptores.
A estimulação sensorial provoca uma forte entrada de Ca2+ nas VSNs, o que indica a ativação do receptor 4,21. Assim, desenvolvemos camundongos transgênicos que expressam G-CaMP2 nos neurônios sensoriais olfativos, incluindo as VSNs 15,22. A sensibilidade e a natureza genética da sonda facilitam grandemente os experimentos de imagem de Ca2+. Este método eliminou o processo de carregamento com corante utilizado em estudos anteriores 4,21. Também empregamos um sistema de entrega de ligantes que permite a aplicação de diversos estímulos aos cortes do órgão vomeronasal. A combinação dessas duas técnicas nos permite monitorar simultaneamente múltiplos neurônios em resposta a um grande número de estímulos. Por fim, estabelecemos um fluxo de análise semi-automatizado para auxiliar o processamento de imagens.
Protocolo
1. Preparação da solução
- Prepare 10X R1, R2 10X e 10X soluções R3 acordo com a tabela.
R1Produtos químicos MW (g / mol) mM (1X) Estoque de 10X (g / L) NaCl 58,44 125 73,05 KCl 74,55 2,5 1,86 MgCl 2 Um estoque M 1 10 ml CaCl 2 · 2H 2 O 147,02 2 2,94 NaH 2 PO 4 · H 2 O 137,99 1,25 ....
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Discussão
A maioria dos receptores vomeronasais (VRs) permanece como receptores órfãos desde sua descoberta por Dulac e Axel 5. Os ligantes feromônicos desses receptores quimiossensoriais e seus papéis na mediação de comportamentos animais ainda não são bem compreendidos. Até o momento, apenas um par ligante/receptor, o peptídeo ESP1 e seu receptor cognato, Vmn2r116 (V2Rp5), foi identificado e demonstrado transmitir informações sociais específicas 19,23. Outro receptor, V1rb2, demonstrou responder à 2-heptano.......
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Divulgações
Nenhum conflito de interesses declarado.
Agradecimentos
Agradecemos a Andrea Moran e aos membros do Serviço de Instalações para Animais de Laboratório (LASF) do Instituto Stowers pelo excelente apoio em manejo animal e serviços técnicos. Este trabalho é financiado por recursos do Instituto Stowers e dos NIH (NIDCD 008003) concedidos a CRY. O conteúdo é de exclusiva responsabilidade dos autores e não representa necessariamente as opiniões oficiais do Instituto Nacional de Surdez e Outros Distúrbios da Comunicação ou dos Institutos Nacionais de Saúde. Patente dos EUA em análise para os camundongos tetO-G-CaMP2, pertencente ao Instituto Stowers, CRY e LM.
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Referências
- Birch, M. C. Pheromones. , North-Holland Pub. Co. & American Elsevier Pub. Co. (1974).
- Wyatt, T. D. Pheromones and animal behaviour : communication by smell and taste. , Cambridge University Press. (2003).
- Papes, F., Logan, D. W., Stowers, L. The vomeronasal organ mediates interspecies defensive behaviors through detection ....
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Reimpressões e permissões
