Descrevemos aqui um protocolo baseado apenas em infecção de células, o que melhora a eficiência da produção de parvovírus recombinante por mais de 100 vezes em comparação com outros protocolos em uso. Este protocolo assenta na utilização de um adenovírus romance 5-base auxiliar contendo o parvovírus unidade de transcrição VP (Ad-VP).
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Artigo de método
Produção Parvovirus eficiente recombinante com a ajuda de Adenovirus sistemas derivados
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
Parvovírus roedores (PV), como ratos H-1PV e MVM, são pequenas Icosaédricos, solteiros encalhados vírus, o DNA. Seu genoma inclui dois promotores P4 e P38 que regulam a expressão de proteínas não estruturais (NS1 e NS2) e da cápside (VP1 e VP2), respectivamente 1. Eles atraem grande interesse como agentes anticâncer para suas habilidades e oncolíticos oncosuppressive enquanto ser não-patogênica para humanos 2. NS1 é o efectora principal de 3 a citotoxicidade virai. A fim de melhorar ainda mais as suas actividades naturais antineoplásicos, derivados a partir destes vectores foram gerados através da substituição do gene que codifica para as proteínas da cápside com um transgene terapêutico (por exemplo, um polipéptido citotóxica, citocina, quimiocina gene do tumor, supressor etc) 4. Os parvovírus recombinantes (recPVs) vector retém as sequências de NS1 / 2 de codificação e os telómeros genoma PV que sejam necessários para amplificação de DNA viral e embalagem. Produção derecPVs ocorre apenas nas células produtoras (geralmente HEK293T), por co-transfecção das células com um vector segundo (pCMV-VP) que expressa o gene que codifica para as proteínas VP (Fig. 1) 4. Os vectores recPV geradas desta maneira são replicação defeituosa. Embora recPVs provou possuir actividades melhoradas oncotoxic com respeito aos vírus parental a partir da qual eles foram gerados, a sua produção continua a ser um importante desafio e fortemente dificulta a utilização destes agentes anti-cancerígenos, em aplicações clínicas.
Encontrámos que a introdução de um vector Ad-5 derivada contendo o E2a, E4 (ORF6) e os genes ARN VA (por exemplo, pXX6 plasmídeo) em HEK293T melhorou a produção de recPVs por mais de 10 vezes em comparação com outros protocolos em uso. Com base nesta constatação, nós construímos um novo Ad-VP-helper que contém os elementos genómicos adenovirais necessárias para aumentar a produção recPVs, bem como a parvovirnos VP unidade gene 5. A utilização de Ad-VP-helper, permite a produção de rec-PVs usando um protocolo que depende inteiramente de passos infecção viral (em oposição a transfecção de plasmídeo), tornando possível a utilização de linhas celulares que são difíceis de transfectar (por exemplo, NB324K) ( Fig. 2). Apresentamos um método que melhora grandemente a quantidade de vírus recombinante produzida, reduzindo tanto o tempo de produção e custos, sem afectar a qualidade do produto final 5. Além disso, a produção em larga escala de recPV (em células em suspensão e biorreatores) é agora concebível.
Protocolo
Note-se que um laboratório com um nível de segurança biológica 2 é necessário para a produção de parvovírus recombinantes (recPV).
O protocolo está subdividido em duas partes principais. A primeira parte (produção de recPV através de transfecção) é necessária para produzir a quantidade mínima de recPVs que serve como inoculo na segunda parte do protocolo (produção de recPVs via infecção). Uma vez que uma pequena quantidade de recPVs é produzido, a primeira parte do protocolo pode ser omitido, e do parvovírus recombinante pode ser amplificado apenas através de infecção proporcionando o gene que codifica para as proteínas da cápside parvoví....
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Discussão
Nós mostramos que a produção de recPV pode ser aumentada pela presença de elementos genómicos adenovirais. Temos aumentou os rendimentos recPV por mais de 10 vezes (0,3-5 TU / célula), fornecendo elemento genómico adenovírus através de transfecção e por mais de 100 vezes o co-infectando as células com Ad-VP-helper em combinação com o recPV em comparação com protocolos convencionais. O protocolo descrito aqui pode ser ainda mais optimizado através da determinação do tempo mais apropriado para a entrega dos elementos genó.......
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Divulgações
Não temos nada a divulgar.
Agradecimentos
Agradecemos a equipe da produção do vírus DKFZ e unidade de desenvolvimento, em particular, Marcus Müller, Münstermann Silvia, Liebetrau Barbara, e Roscher Mandy. Este estudo foi parcialmente financiado por doações do Ministério Federal da Educação e Pesquisa (BMBF) e da Associação Helmholtz, no âmbito do Krebsforschungszentrum Deutsches / Cancéropôle du Grand-Est Programa conjunta em Tumor Applied Virology.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Nome do reagente | Companhia | Número de catálogo | |
| DMEM | Sigma | D5796 | |
| MEM | Sigma | M4655 | |
| Soro Bovino Fetal | PAA | A15-101 | |
| L-Glutamina | Gibco | 25030-024 | |
| Fugene | Roche | 047097050001 | |
| Tripsina-EDTA | Invitrogen | 25300062 | |
| Benzonase Nuclease | Sigma | E8263 | |
| Adeno-X rápida Titer Kit | Clontech | 632250 |
Referências
- Cotmore, S. F., Tattersall, P. Parvoviral host range and cell entry mechanisms. Adv. Virus. Res. 70, 183(2007).
- Rommelaere, J. Oncolytic parvoviruses as cancer therapeutics. Cytokine Growth Factor Rev. 21, 185(2010).
- Hristov, G.
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Reimpressões e permissões
