Artigo de método

Radioativo In situ Hibridação para detecção de padrões de expressão dos genes nos tecidos diversos

DOI:

10.3791/3764

⸱

27 de abril de 2012

 ,  , 
1Howard Hughes Medical Institute, Department of Neurobiology, Duke University , 2Department of Biological Sciences, Hokkaido University

Neste artigo

Resumo

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Este protocolo é usado com sucesso para detectar quantitativamente os níveis e padrões espaciais de expressão de mRNA em vários tipos de tecido em todas as espécies de vertebrados. O método pode detectar transcritos baixa abundância e permite o tratamento de centenas de lâminas simultaneamente. Apresentamos este protocolo com perfil de expressão de formação cérebro das aves embrionárias como um exemplo.

Resumo

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Sabendo o tempo, o nível, a localização celular, e tipo de célula que um gene é expresso em contribui para a nossa compreensão da função do gene. Cada uma destas características pode ser realizado com a hibridização in situ para mRNAs dentro das células. Aqui apresentamos uma radioativo no método de hibridização in situ modificado de Clayton et al. (1988) 1 que tem trabalhado com sucesso em nosso laboratório por muitos anos, especialmente para adultos cérebros vertebrados 2-5. Os longos complementares de RNA (cRNA) sondas com a sequência alvo permite a detecção de transcritos baixa abundância 6,7. Incorporação de nucleótidos radioactivos para as sondas crna permite ainda mais a sensibilidade de detecção de transcritos baixa abundância e análises quantitativas, quer pela luz filme de raios-X sensível ou emulsão revestido sobre o tecido. Estes métodos de detecção de fornecer um registo de longo prazo da expressão do gene alvo. Em comparação com os não-radioativo sonda methODS, tais como DIG-rotulagem, o método de hibridação da sonda radioactiva não requer passos de amplificação múltiplas usando HRP-anticorpos e / ou TSA kit para detectar transcritos baixa abundância. Portanto, este método proporciona uma relação linear entre a intensidade do sinal e quantidades de mRNA-alvo para a análise quantitativa. Ele permite o processamento simultâneo 100-200 lâminas. Ele funciona bem para diferentes estágios de desenvolvimento de embriões. A maioria dos estudos de desenvolvimento de expressão do gene utilizar embriões inteiros e não radioactivos abordagens 8,9, em parte porque o tecido embrionário é mais frágil do tecido adulto, com menos de coesão entre as células, tornando-a difícil de ver os limites entre as populações de células com secções de tecido. Em contraste, a nossa abordagem radioactivos, devido à maior gama de sensibilidade, é capaz de obter maior contraste na resolução da expressão do gene entre as regiões de tecido, tornando-o mais fácil de ver os limites entre as populações. Usando este método, os pesquisadores poderiam revelar apossível significado de um gene recentemente identificado, e ainda prever a função do gene de interesse.

Protocolo

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1. Preparação de Tecidos

  1. Colher tecidos frescos. Para os embriões de aves, ovos cuidadosamente abrir e limpar o embrião em um prato com 1xPBS, duas vezes. Para cérebros adultos, remover rapidamente o cérebro e lavar cuidadosamente com 1 x PBS.
  2. Incorpore embriões ou cérebro adulto em um molde incorporado cheia de outubro tecido tek, orientando o tecido conforme necessário para cortar e congelar rapidamente o bloco, colocando-o em uma mistura de etanol e gelo seco, tomando cuidado para não começar a mistura dentro do bloco .
  3. Corte a amostra congelada em um criostato em 10-12 mM de espessura. Para o tecido cerebral e embrionário, a melhor temperado de corte está dentro do intervalo de -18 ° C a -20 ° C.
  4. Monte cortes congelados em slides Super Plus vidro.
  5. Guarde as seções de uma caixa de lâminas a -80 ° C.

2. Geração de Riboprobes radioativos (Utilize procedimentos de segurança de radiação da sua instituição)

  1. Gerar um DN purificada linearUm modelo da sua ADNc de interesse, quer por digestão enzimática restrito de um fragmento clonado rodeado por locais de RNA polimerase promotor de um DNA de plasmídeo, ou por PCR do inserto ligado aos locais de polimerase de RNA de promotor de ligação. Também é possível gerar fragmentos de PCR com os promotores da polimerase de RNA, como parte da extremidade 3 'e 5' iniciadores de PCR. Géis purificar suas restritas ou PCR fragmentos gerados com o kit GENECLEAN gel purificação.
  2. Para um tubo Eppendorf 0,5 ml, adicionar 0,5-1 ug de molde de ADN purificado linear, tampão de transcrição, DTT, RNasin, AGC solução mistura de nucleótidos, e RNase água livre para levar o volume até a quantidade desejada. Em seguida, adicione S 35-UTP e da RNA polimerase adequada para fazer riboprobes quer antisense ou sentido.
  3. Incubar a mistura durante 1 hora num banho de água 37 ° C. Adicionar outra aliquota de RNA polimerase e incubar durante outra 1 h.
  4. Adicionar 3M solução de acetato de sódio (0,1 vezes do volume total) e 100% de EtOH (2,5 fold do volume total) dentro do tubo de Eppendorf para precipitar o sintetizado riboprobe RNA.
  5. Incubar em gelo seco ou -80 ° C durante 15 min ou mais de 3 horas para auxiliar a precipitação.
  6. Pelete de RNA por centrifugação a 4 ° C e 15.000 rpm numa centrífuga de bancada Eppendorf durante 30 min.
  7. Remover o sobrenadante e lava-se o sedimento com EtOH a 70%, toque com o dedo para misturar o sedimento bem.
  8. Pelete de RNA de novo por centrifugação a 4 ° C e 15.000 rpm durante 30 min.
  9. Remover o sobrenadante completamente por pipetagem e depois adicionar 40 uL solução de hibridação. Misture bem por pipetagem dentro e para fora.
  10. Coloque 1 ul da solução em 3 ml de solução de Segurança-Solve na mistura de cintilação frasco, bem, e medir as contagens no contador de cintilação.
  11. Coloque a Eppendorf com o riboprobe a -20 ° C para utilização dentro de uma semana.

3. Tratamento tecido

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Discussão

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Radioactivos hibridação in situ da expressão do mRNA é amplamente utilizado para fins múltiplos, incluindo para estudar organização do tecido regional, tipos de células, e actividade funcional do cérebro 2-5,10,12-14. O uso mais tarde está em genes cuja expressão de mRNA no cérebro é dependente da atividade neural maior, muitas vezes chamado de atividade dependentes de genes ou genes imediatos iniciais. Com estas utilizações, o nosso método foi aplicado em várias espécies múltiplas, incluindo, em aves, mamíferos (por exemplo, humanos), peixes e anfíbios; em múltiplos tecidos, incluindo o cérebro, pele, músculo e; e idades múltiplas, incluindo hatchlings / recém-nascidos, juvenis , os adultos, e aqui em seções inteiras de embriões 2,3,5,15-17. As características especiais do nosso protocolo incluem: (1) Ela produz um equilíbrio entre a especificidade anatômica e especificidade quantitativa. Para quantificar a expressão gênica no filme de raios-x, tiramos fotos digitais das imagens (ex:. Figura 1A e 1B), use o Photoshop função de histograma (Adobe) para medir a densidade de pixels nas regiões de interesse e subtrair os níveis de fundo sobre o filme exterior do tecido, mas ainda na lâmina de vidro 2,4. Para quantificar a expressão a nível celular, tomamos imagens de grãos de prata sobre as células sob ampliação elevada (40-100X; Fig. 4). Em seguida, usamos o limiar e medindo funções de J Imagem por Wayne Rasband no NIH para contar o número de grãos de prata na imagem, subtrair a contagem de fundo em uma área similar sem células sobre a lâmina de vidro, dividir pelo número de células, para obter um valor de expressão por célula. 4,18 (2) Pode ser rendimento relativamente elevado, permitindo o processamento de 100-200 lâminas simultaneamente, devido à vedação lamela apertado criado pelo banho de óleo mineral. Métodos padrão de hibridização in-situ demorar mais tempo para selar as lâminas com parafilme, unha polonês, e outros meios, onde lâminas ocupam muito espaço, (3) É altamentesensível para as transcrições baixa abundância devido ao sulfato de dextrano e solução de Denhardt no tampão de hibridação 2,13, (4) A abordagem de imagem em campo escuro produz imagens de alto contraste devido a fotografar sob iluminação de campo escuro sobre um microscópio de dissecação 4,5. Além disso, permite a detecção sensível de pequenas alterações na expressão do gene, tais como na actividade dependente da expressão do gene para identificar regiões específicas do cérebro activadas durante a percepção e produção de comportamentos específicos 19. As limitações em relação ao não-radioactivos protocolos são que estas últimas são mais clara na resolução celular e da localização do mRNA no interior da célula, e trabalhando com a emulsão é muito sensível à manipulação e da luz. É possível combinar o nosso método com outros métodos, tais como não radioactivo em hibridização in situ para rótulo de expressão de mRNA de mais de um gene no mesmo tecido 10,17,20. Ele pode ser combinado com imunocitoquímicapara rotular RNA e expressão da proteína sobre a mesma amostra, a fim de co-localizar o ARNm com certos tipos de células 10. As modificações protocolo necessário para tais experiências dupla marcação são descritas nas referências citadas.

Em resumo, a nossa abordagem facilita a compreensão do tempo e localização celular da expressão do gene, a fim de entender organização região, a atividade do tecido funcional e da função do gene.

Divulgações

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Não temos nada a divulgar.

Agradecimentos

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Os autores gostariam de agradecer a todos os membros Jarvis laboratório que melhoraram o protocolo ao longo dos anos.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Nome do reagente Companhia Número de catálogo Comentários
Anidrido acético VWR MK242002
Clorofórmio VWR BDH1109
Acetato de cresil violeta Sigma C5042
Criostato Thermo Scientific Microm HM550
Formamida deionizada Sigma F9037
TDT Promega P1171 100mM
EDTA Sigma ED
Incorporação de molde VWR 15160-215
Fisher marca Superfrost mais slides Fisher Scientific 22-034-979
Formaldeído VWR BDH0506-4LP
Formamida Sigma F7508
GENECLEAN kit Q-Bio gene 1001-200
Kodak BioMax MR filme Sigma Z350370
Kodak NTB Emulsão A Carestream Health 8895666
Kodak Professional desenvolvedor D19 Câmera fotográfica 1462593
Kodak profissional Fixer Câmera fotográfica 1971746
β-mercaptoetanol Calbiochem 444203
Óleo mineral VWR IC15169491
NaOH VWR SX0600-1
Paraformaldeído Sigma 76240
Poli A Invitrogen POLYA.GF
rATP Promega P1132 10mM
RCTP Promega P1142 10mM
rGTP Promega P1152 10mM
RNasin Promega N2111 40Units/μl
S 35 UTP PerkinElmer NEG039C001MC
Safety-Solve solução Segurança Resolva Research Products International 111177
Acetato de Sódio Sigma S7899 3M
Fosfato de sódio dibásico Sigma S3264
Fosfato de sódio monobásico Sigma S3139
SP6RNA polimerase Promega P1085
Coloração prateleira de metal Electron Microscopy Sciences 70312-54
T7 RNA polimerase Promega P2075
Tissue-Tek outubro Sakura 4583
Transcrição tampão 5x Promega P1181
Trietanolamina VWR IC15216391
Tris-HCl (1 M, pH 8,0) VWR 101449-446
tRNA Roche 10109509001

Soluções:

  1. Reagentes para fazer de riboprobes: 1,5 modelo DNA ul (0,2-0,3 mg / mL), 2 ul de tampão de transcrição 5x otimizado, 1 ml de DTT 100mM (vem com Polimerase de Promega, mixbem à temperatura ambiente), 0,3 ul de RNasin (40 unidades / uL), 1,5 ul de solução de AGC mistura ribonucleótido, 3,5 ul de S 35 UTP, e uma polimerase de ARN uL. Traga até 10 ul com nuclease livre de água.
  2. AGC solução mix ribonucleotídeo: misture quantidades iguais de 10 mM ATP, GTP e CTP juntos.
  3. Solução de acetato de sódio para EtOH precipitação para remover 35 S livre UTP: 40 ul de ARNase e ADNase água livre, 5 ul de acetato de sódio 3M, e 125 uL de EtOH a 100%.
  4. Tampão de hibridação (10 mL de stock): 5 ml de 100% de formamida desionizada, 600 ul de NaCl 5M, 1M Tris-HCl (pH = 8,0), 240 ul de EDTA 0,5 M (pH = 8,0), 100 uL de solução de Denhart 100x, o 100 ul de 1M de DTT, 250 uL de 20mg/ml tRNA, 125 uL de 20 mg / ml de poli A, e 1 g de sulfato de sódio dextrano. Adicionar DEPC tratada com água para levar o volume total para 10 ml. Agita-se vigorosamente e depois incubar a 55 ° C até que todo o sulfato de sódio dextrano é dissolvido. Armazenar o tampão de hibridação em-20 ° C, que é bom para ~ 6 meses.
  5. 4% tamponado solução de paraformaldeído: Adicionar 40 g de paraformaldeído em 760 ml de água destilada em um balão de designado para paraformaldeído, o calor a 50 ° C sobre uma placa quente com agitação. Adicionar 320 uL de NaOH 10N para ajudar a dissolver o paraformaldeído. Depois de se dissolver (~ 10 min), adicionar 100 ml de PBS 10x, e trazer o volume com água destilada até 1 litro. Agita-se e aquecer a solução até paraformaldeído é dissolvido. O pH deve ser de 7,4.
  6. Tampão de acetilação: 13,6 ml de trietanolamina, mais 2,52 ml de anidrido acético em 1 litro de água destilada.
  7. 20x SSPE solução: 3M NaCl, 200 mM de NaH 2 PO 4-H2O, e 200 mM de EDTA em água destilada. Ajuste a solução para pH 7,4 com NaOH 10N.
  8. 10x tampão PBS: 80g de NaCl, 2,0 g de KCl, 14,4 g de Na 2 HPO 4, e 2,4 g de KH PO 2 4 em água destilada. Ajuste a solução a pH 7,0 e trazer o volume total a 1 Liter.
  9. Solução de lavagem segundo: 0,1% β-mercaptoetanol e formamida a 50% em 2x SSPE
  10. Solução de acetato de cresilo violeta: acetato de violeta de cresilo 3% em água da torneira (água destilada impede coloração bom), dissolvido durante a noite, com agitação num balão à temperatura ambiente. Filtrar por sucção a vácuo através de um Whatman 1 milímetro filtro de papel e um funil de Buchner.

Referências

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