Um método para espácio-temporal controlo da actividade GTPase pequena pela luz é descrito. Este método baseia-se em rapamicina induzida heterodimerização FKBP-FRB e foto-enjaulamento sistemas. Otimização de luz irradiação permite a ativação espaço-temporalmente controlada de pequenas GTPases no nível subcelular.
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Artigo de método
Espaço-Temporal Manipulação de Atividade GTPase Pequeno em nível subcelular e em escala de tempo de segundos em células vivas
Neste artigo
Resumo
Resumo
Regulação dinâmica da família Rho de trifosfatases guanosina pequenas (GTPases) com precisão espaço-temporal grande é essencial para várias funções celulares e eventos 1, 2. A sua natureza dinâmica spatiotemporally foi revelada pela visualização da sua actividade e localização em tempo real 3. A fim de obter uma compreensão mais profunda dos seus papéis em diversas funções celulares a nível molecular, o próximo passo deve ser perturbação das actividades de proteína a uma localização precisa subcelular e de temporização.
Para atingir este objectivo, desenvolvemos um método para a induzida pela luz, num espaço-temporal activação controlada de GTPases pequenas pela combinação de duas técnicas: (1) rapamicina induzida heterodimerização FKBP-FRB e (2) um método de foto-enjaulamento de rapamicina. Com o uso de rapamicina mediada heterodimerização FKBP FRB-, desenvolvemos um método para rapidamente induzível activação ou inactivação de pequeno GTPases including Rac 4, Cdc42 4, RhoA 4 e 5 Ras, em que a rapamicina induz a translocação de FKBP-fundidos GTPases, ou os seus activadores, para a membrana plasmática, onde está ancorada FRB. Para o acoplamento com o presente sistema de heterodimerização, também desenvolvido um sistema foto-enjaulamento de análogos de rapamicina. Um composto de foto-engaiolados é uma molécula pequena, cuja actividade é suprimida com um grupo fotocliváveis proteger conhecido como um grupo de encarceramento. Para suprimir a actividade heterodimerização completamente, foi elaborado um rapamicina engaiolados que está preso a uma macromolécula tal que o complexo resultante grande não pode atravessar a membrana plasmática, levando a virtualmente nenhum fundo actividade como um dimerizer química no interior das células 6. A Figura 1 ilustra um esquema do nosso sistema. Com a combinação destes dois sistemas, é localmente recrutado um activador Rac para a membrana plasmática num espaço de tempo de segundos, e conseguido induzida pela luz de activação Rac no lev subcelularel 6.
Protocolo
1. A transfecção de DNA de plasmídeo
- Adicionar DNAs plasmídicos, 0,5 ug FRB membrana amarrado (daqui em diante referido como LDR) e 0,5 ug FKBP-Tiam1 (T-cell lymphoma invasão e metástase indutora de proteína 1: Rac activador) marcado com proteína fluorescente para 37,5 uL dH 2 O. Adicionar 1 ml FuGENE HD.
- Vortex e incube à temperatura ambiente durante 20 minutos. Enquanto isso, vá para as etapas 1,3-1,8.
- Lava-se cada poço de uma câmara de 8-bem com 50 uL de poli-D-lisina.
- Lavar o centro de cada poço com dH 2 O.
- Trypsinize 80-85% confluentes células NIH-3T3 e diluir até 10 mL meio de cultura (DME....
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Discussão
Nós descrevemos uma técnica que utiliza um novo composto engaiolados em conjunto com o sistema de heterodimerização FKBP-FRB, a fim de manipular Rho actividade GTPase a uma localização precisa subcelular numa escala de tempo de segundos.
Há três limitações da presente abordagem. Em primeiro lugar, porque o método baseia-se na prevenção ou permitindo a difusão de dimerizer através da membrana plasmática, a localização do alvo celular necessita de ser membrana plasmática ou na sua vizinhança. .......
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Divulgações
Não há conflitos de interesse declarados.
Agradecimentos
Este estudo foi financiado pelo NIH o financiamento da investigação (DK090868 e GM092930 de TI). Existe uma patente pendente sobre um análogo rapamicina enjaulado.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Nome do reagente / equipamentos | Companhia | Número de catálogo | |
| Rapamicina | Tecoland | RAPA99 | |
| FuGENE HD | Roche | 04709691001 | |
| Avidina | Sigma | A9275-10MG | |
| DMSO | Sigma | D2650-5X5ML | |
| Coluna de exclusão de tamanho | GE Healthcare | Giro Armadilha G-25 | |
| Com fundo de vidro câmara de 8-bem | Thermo Scientific | 12-565-47 | |
| Microscópio de fluorescência invertido | Zeiss | Axiovert200M | |
| UV fonte de luz LED | Rapp Opto Eletrônica | UVILED | |
| Disco giratório Confocal | Yokogawa Electric Corp | CSU10 | |
| CCD da câmera | Hamamatsu Photonics | ORCA-ER | |
| Da Objectiva 100x | Zeiss | Apochromat Plano |
Esquema sintético do crb (Copyright ACS2011) 6
Condições sintéticas: (a) BnBr, K 2 CO 3, DMF (b) f.HNO 3, AcOH (c) TFA (d) propargil-Br, K 2 CO 3, DMF, (e) gato glicerol,. PTSA, tolueno (f) NaBH3CN, TiCl4, MeCN (g) Tf 2 O, piridin (h) de metanol HCl, (i) LiAlH 4, THF (j) TsCl, piridina, CH 2 Cl 2 (k) NaN 3, DMF (l) 8, 2,6-di-t-butilpiridina, 2 CH Cl 2 (m) 13, CuSO4, ascorbato, 2-propanol, H2O, CH 2 Cl 2.
Referências
- Etienne-Manneville, S., Hall, A. Rho GTPases in cell biology. Nature. 420, 629-635 (2002).
- Takai, Y., Sasaki, T., Matozaki, T. Small GTP-binding proteins. Physiol. Rev. 81, 153-208 (2001).
- Kiyokawa, E., Aoki, K., Nakamura, T., Matsuda, M.
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Reimpressões e permissões
