Fluxos de trabalho de isótopos estáveis de rotulagem empregando 18 O-água enriquecida (Leo-fluxos de trabalho) são ferramentas versáteis para estudos quantitativos e qualitativos proteômica. Nos fluxos de trabalho protease assistidas (Paleo), 18 O-átomos são introduzidos por clivagem proteolítica e reacções de permuta de oxigénio carboxilo mediada por proteases. No catalisada por ácido de fluxo de trabalho (Aleo), 18 O-átomos são introduzidos por troca de oxigénio carboxilo a pH baixo.
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Artigo de método
Protease e catalisada por ácido Workflows Labeling Empregando
Neste artigo
Resumo
Resumo
Isótopos estáveis são ferramentas essenciais em espectrometria de massa biológica. Historicamente, 18 O-isótopos estáveis têm sido extensivamente utilizadas para estudar os mecanismos catalíticos das enzimas proteolíticas 1-3. Com o advento da espectrometria de massa à base de proteomics, a incorporação catalisada enzimaticamente, de 18 átomos de O-água isotopicamente enriquecido estável tornou-se um método popular para comparar quantitativamente os níveis de proteína de expressão (revisto por Fenselau e Yao 4, Miyagi e Rao 5 e Ye et al. 6). 18 O-rotulagem constitui uma alternativa simples e de baixo custo para produtos químicos (por exemplo iTRAQ, ICAT) e metabólicas (por exemplo, técnicas de SILAC) rotulagem 7. Dependendo da protease utilizada, 18 O-rotulagem podem resultar na incorporação de até dois átomos de O-18 no grupo carboxilo C-terminal do produto de clivagem 3 8. Em nossa Paleo (p rotease-a e Abeling ssisted l mploying 18 O enriquecido água) adaptação de enzimática 18 O rotulagem, utilizamos 50% de água 18 O enriquecido para produzir assinaturas isotópicas distintas. Em combinação com a alta resolução de laser assistida por matriz de ionização de dessorção de tempo-de-voo espectrometria de massa tandem (MALDI-TOF/TOF MS / MS), os envelopes isotópicos característicos podem ser usados para identificar os produtos de clivagem com um elevado grau de especificidade. Nós já ter usado o Paleo metodologia para detectar e caracterizar proteases endógenas 9 e monitorar reações proteolíticas 10-11. Desde Paleo codifica a própria essência da reação de clivagem proteolítica, a instalação experimental é Enri simples e bioquímicoschment passos de produtos de clivagem podem ser contornados. A paleo-método pode ser facilmente estendido para (i) o curso experiências que monitoram a dinâmica de reações de clivagem proteolítica e (ii) a análise da proteólise em amostras biológicas complexas que representam condições fisiológicas. Paleo-TimeCourse experimentos ajudar a identificar passos limitação de taxa de processamento e intermediários de reação em complexas reações via proteolíticas. Além disso, a reacção de Paleo permite-nos identificar as enzimas proteolíticas como a tripsina serina-protease que é capaz de associar novamente os seus produtos de clivagem e de catalisar a incorporação de um 18 segundo O-átomo. Tais "etiquetagem dupla" enzimas podem ser utilizados para postdigestion 18 O-rotulagem, em que os péptidos marcados são exclusivamente através da reacção de oxigénio carboxil troca. A nossa estratégia terceira estende rotulagem empregando água 18 ó enriquecido além enzimas e utiliza condições de pH ácido para introduzir 18 sinal isótopo estável O-Atures em peptídeos.
Protocolo
Os apresentados Leo-workflows permitem a rotulagem de isótopos estáveis de proteína digere e peptídeos sintéticos. Estas experiências de cursos de tempo (Figura 1) são aplicáveis a estudos comparativos e quantitativa do proteoma, bem como pesquisas protease. Cada fluxo de trabalho é constituído por duas etapas experimentais (figura 2): A) O tempo de amostragem do respectivo resolvido 18O-stable isotope reacção codificado (protease catalisada clivagem do péptido; protease catalisada reacção de permuta de oxigénio carboxilo; catalisada por ácido a troca de oxigénio carboxil reacção) e B), análise por espectrometria de ma....
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Resultados
Utilizou-se o fluxo de trabalho Paleo TimeCourse para monitorar dinamicamente a incorporação de 18 O-isótopos estáveis em produtos de clivagem de péptidos geradas por enzimas proteolíticas. A abordagem apresentada é uma ferramenta versátil para estudar comparativamente vias de processamento proteolíticas de diferentes substratos e combinações de protease. Por amostragem reacções proteolíticas repetidamente durante o curso da reacção, o experimento Paleo TimeCourse fornece instantâneos resolvida no tempo de .......
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Discussão
Através da combinação de rotulagem isótopo estável e de elevada resolução em espectrometria de massa de uma forma resolvida no tempo, o método Paleo TimeCourse-permite uma análise dinâmica da geração de produtos peptídicos. O ensaio pode ser utilizado para gerar péptidos marcados isotopicamente estáveis para estudos quantitativos e qualitativos proteómica e avaliar a cinética através da qual os péptidos proteotypic são gerados. Além disso, Paleo TimeCourse foi concebido para avaliar as vias proteolíticas sob específic.......
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Divulgações
Não há conflitos de interesse declarados.
Agradecimentos
Este trabalho foi financiado pelo NIH / NIDCR Grant 1R01DE019796.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Nome de material | Companhia | Número de catálogo | |
| Colunas PepClean C-18 de Spin | Thermo | 89870 | |
| Opti-TOF 384 placa-alvo MALDI | AB SCIEX | 1016629 | |
| 4800 MALDI TOF / TOF | AB SCIEX |
Tabela 1. Materials
| Nome do reagente | Companhia | Número de catálogo |
|---|---|---|
| O ácido alfa-ciano-4-hidroxicinâmico | Sigma Aldrich | 70990-1G-F |
| Albumina de soro bovino (BSA) | Sigma Aldrich | A3294-10G |
| Ditiotreitol (DTT) | Acros | 16568-0050 |
| Iodoacetamida (IAM) | Sigma Aldrich | 1149-5G |
| Enzima conversora de endotelina-1 (ECE-1) | R & D Systems | 1784-ZN |
| Tripsina Ouro | Promega | V5280 |
| Água-18 O, 97% átomo de 18 O | Sigma Aldrich | 329878-1G |
| Ácido trifluoroacético (TFA) | Thermo | 28904 |
| Kit Padrões de massa para Calibração de AB SCIEX TOF / TOF instrumentos | AB SCIEX | 4333604 |
Tabela 2. Reagentes
Referências
- Bender, M., Kemp, K. Oxygen-18 Studies of the Mechanism of the alpha-Chymotrypsin-catalyzed Hydrolysis of Esters. Journal of the American Chemical Society. 79, 111-116 (1957).
- Sharon, N., Grisaro, V., Neumann, H.
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Reimpressões e permissões
