NADPH oxidase é a principal fonte de espécies reactivas de oxigénio (ROS) em fagócitos. Por causa da natureza efêmera de ROS, é difícil de medir e monitorar os níveis de ROS em animais vivos. Um método minimamente invasivo para quantificação de série de ROS em ratos vivos é descrito.
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Artigo de método
Imagem de bioluminescência de NADPH oxidase em diferentes modelos animais
Neste artigo
Resumo
Resumo
NADPH oxidase é uma enzima importante que medeia a defesa do hospedeiro antibacteriana e antifúngica. Em adição ao seu papel na defesa do hospedeiro antimicrobiana, NADPH oxidase tem funções críticas de sinalização que modulam a resposta inflamatória 1. Assim, o desenvolvimento de um método para medir, em "tempo real", a cinética da NADPH-oxidase geração de ROS derivado deve ser uma ferramenta de investigação valiosa para compreender os mecanismos de defesa do hospedeiro em causa, inflamação e lesão.
A doença granulomatosa crônica (CGD) é uma desordem hereditária do NADPH oxidase caracterizada por infecções graves e inflamação excessiva. A activação da NADPH oxidase de fagócitos requer translocação das suas subunidades citosólicas (phox p47, p67 phox, e p40 phox) e Rac a um flavocytochrome ligada à membrana (composto de um phox gp91 e p22 phox heterodímero). Perdafunção de mutações em qualquer um destes componentes resultado NADPH oxidase na CGD. Semelhante ao dos pacientes com CGD, gp91 phox camundongos deficientes e P47 phox camundongos deficientes têm defeito oxidase de fagócitos NADPH e de acolhimento prejudicada defesa 13, 14. Além de fagócitos, que contêm os componentes da NADPH oxidase descritos acima, uma variedade de outros tipos de células expressam diferentes isoformas da NADPH-oxidase.
Aqui, descrevemos um método para quantificar a produção de ROS em camundongos vivos e delinear a contribuição da NADPH oxidase para a geração de ROS em modelos de inflamação e lesão. Este método baseia-se ROS reagir com L-012 (um análogo do luminol) para emitir luminescência que é gravada por um dispositivo de carga acoplada (CCD). Na descrição original da sonda L-012, L-012-dependente de quimioluminescência foi completamente abolido pela superóxido-dismutase, o que indica que o principal ROS detectado nesta reacção foi superanião óxido 15. Estudos subsequentes têm mostrado que o L-012 pode detectar outros radicais livres, incluindo as espécies reactivas de azoto 16, 17. Kielland et al. 17 mostrou que a aplicação tópica de acetato de miristato de forbol, um activador potente da NADPH-oxidase, levou a NADPH oxidase-dependente de geração de ROS, que pode ser detectada em ratos usando o teste luminescente L-012. Neste modelo, eles mostraram que a luminescência L-012-dependente foi abolida em p47 phox camundongos deficientes.
Nós comparamos geração de ROS em ratinhos de tipo selvagem e da NADPH-oxidase deficiente phox p47-/ - 2 ratos nos três seguintes modelos: administração 1) intratraqueal de zimosan, uma célula pro-inflamatório fúngico parede derivado do produto que podem activar a NADPH oxidase, 2) ligadura e perfuração cecal (CLP), um modelo de sepse intra-abdominal com inflamação pulmonar aguda e lesão secundária e 3) tetracloreto de carbono por via oral(CCl 4), um modelo de ROS-dependente lesão hepática. Estes modelos foram seleccionados para avaliar especificamente NADPH oxidase-dependente de geração de ROS no contexto de inflamação não infecciosa, sepse polimicrobiana e toxina induzida por lesão de órgãos, respectivamente. Comparando bioluminescência em camundongos de tipo selvagem de p47 phox-/ - ratos nos permite delinear a contribuição específica de ROS gerado pelo p47 oxidase phox contendo NADPH para o sinal bioluminescente nesses modelos.
Resultados de imagem de bioluminescência que demonstraram níveis elevados de ROS em ratinhos de tipo selvagem em comparação com p47 phox-/ - ratos indicaram que a NADPH oxidase é a principal fonte de produção de ROS em resposta a estímulos inflamatórios. Este método oferece uma abordagem minimamente invasiva para "real-time" monitoramento da geração de ROS durante a inflamação in vivo.
Protocolo
1. Modelos Animais
- Ratos: Use p47 phox-/ - ratos e camundongos idade e sexo pareados C57BL6/DBA. Obter aprovação para as experiências de Animal Care Institucional e Comitê de uso.
- Anestesia: Use um sistema de administração contínua isoflurano para induzir a anestesia. O sistema de vaporizador (VetEquip) é preenchido com isoflurano (2-3%). Confirmar que os ratos são totalmente anestesiado pela observação da respiração, movimento e reflexo da córnea em resposta a estímulos externos.
- Procedimentos cirúrgicos: Esfregue a área cirúrgica (bancada) com etanol 70%. Usar luvas estéreis e um vestido cirúrgico limpo e máscara. Preparar os ratos por recorte do cabelo e aplicação de betadine alternando com etanol a 70% para a área onde a incisão será feita. Realizar uma cirurgia em uma superfície estéril e usar instrumentos esterilizados. Monitor de ratos pós-operatório até acordado e se movendo livremente.
- Zymosan administração intratraqueal
- Administrar anestesiacomo descrito na secção 1.2.
- Desinfectar área cirúrgica (pescoço) com betadine e 70% de etanol e expor a traqueia por dissecção cirúrgica.
- Pierce traqueia com uma agulha de calibre 27 e injectar zimosan (St. Louis, MO) a uma dose de 1 ug / g utilizando uma 0,5 mg / uL solução (volume total de 50 ul de um ratinho de 25 g) dissolvida em PBS estéril.
- Pescoço ratinhos perto enrolada com fio de seda 5-0 estéreis sob condições assépticas.
- Imagem após 4 horas e 24 horas.
- Ligadura e perfuração cecal
- Administrar anestesia, como descrito na secção 1.2.
- Grampo de cabelo na área cirúrgica (abdómen) e desinfectar com betadine e etanol 70%.
- Executar uma laparotomia mediana e identificar o ceco.
- Ligar o 50% distal do ceco exposta com fio de seda 4-0 e ceco punção distal à ligadura com uma passagem de uma agulha de calibre 21.
- Fechar a incisão com suturas de seda 4-0 estéreis.
- Imagem depois de 4 horas e24 hr.
- Oral tetracloreto de carbono (CCl 4) administração
- Administrar anestesia, como descrito na secção 1.2.
- Administrar CCl 4 (2 ng / g, St. Louis, MO), dissolvido em óleo de milho por meio de gavagem oral. O procedimento de CCl4 administração deve ser realizada em uma área designada de acordo com o IBC / EHS políticas.
- Imagem após 4 horas e 24 horas.
2. Adquirir uma imagem Bioluminescent
- Inicializar o IVIS 200 (Xenogen Corporation, Alameda, CA) Imaging System, configurado para o modo de luminescência, e esperar que o dispositivo de carga acoplada (CCD) de temperatura para bloquear.
- Selecione o tempo de exposição, binning (médio) e F / Stop (8) definições.
- Ratinhos coloque em posição supina na câmara de imagem em uma fase aquecida para manter a temperatura corporal normal. Administrar anestesia como descrito em 1.2 através de cone do nariz enquanto os ratos estão na câmara de imagem IVIS.
- Administrar L-012 (20 ug / g), dissolvido em PBS estéril (10 ug / uL) por via intravenosa retro-orbital de injecção em cada ponto de tempo seleccionado para a imagem latente.
- Captar imagens a partir de 2 min após injecção de L-012. Normalmente usamos uma exposição 40 seg.
3. Análise de Dados utilizando Região de Interesse
- Analisar os dados utilizando software imagem viva v.4.2 (Xenogen Corporation, Alameda, CA).
- Abra uma imagem e selecionar a medição da Região de ferramentas de juros.
- Selecione a Região de forma e tamanho interesse sobre o peito e / ou abdome após sobreposição de uma imagem pseudo-colorido digital (representando a detecção de fótons) sobre uma imagem fotográfica do mouse.
- Quantificar a intensidade do sinal (fóton fluxo) da região de interesse.
4. Estatística
- Usar pacote de software de análise estatística para executar two-way ANOVA com pós-teste de Bonferroni em momentos individuais.
Zymosan é um pró-inflamatória levedura produto da parede celular e um potente activador de NADPH-oxidase 3. Que anteriormente mostraram que zymosan intratraqueal induz uma inflamação pulmonar neutrofílica mais robusto e pró-inflamatória da produção de citocinas em p47 phox-/ - em comparação com a estirpe selvagem ratos 1. Aqui, nosso objetivo foi o de comparar a geração de ROS nos pulmões de tipo selvagem e p47 phox-/ - ratos após desafio zymosan. Às 4 horas após a administração de zymosan intratraqueal, observou-se um aumento significativo da emissão de fotões sobre o peito em ratinhos de tipo selvagem em relação à linha de base, bem como um aumento na emissão de fotões, em comparação com o tipo selvagem p47 phox-/ - murganhos em 4 h e 24 h. Em contraste, os sinais de bioluminescência em p47 phox-/ - ratinhos mantiveram-se em níveis de linha de base em 4 h após o tratamento por zimosan (Fig.1 AB). Assim, parece NADPH oxidase be a principal fonte de geração de ROS nos pulmões a seguir à administração zymosan.
Em seguida, foi avaliada a produção de ROS no modelo de sepse por CLP induzido. A sepse é uma síndrome com risco de vida associado com lesões de órgãos-, incluindo lesão pulmonar aguda (LPA) e síndrome do desconforto respiratório agudo (SDRA) 4, 5. ROS mediada por lesão foi considerado um factor importante dirigir-sepsia induzida por disfunção de múltiplos órgãos. Descobrimos que ROS foram significativamente aumentados sobre o peito (4 horas) e sobre o abdômen (24 horas) após CLP em camundongos de tipo selvagem em comparação à linha de base. No entanto, os níveis de ROS em p47 phox-/ - ratos foram semelhantes aos níveis de base em ambos os pontos de tempo (Fig.2 AC). Estes resultados mostram que a geração de ROS no modelo do rato induzida por CLP sepse é dependente da NADPH-oxidase.
Finalmente, utilizou-se imagiologia bioluminescente para detectar a produção de ROS em um modo de lesão induzida por CCl 4 fígadol. CCl 4 provoca a necrose hepatocelular, e tem sido utilizado para modelar ambos lesão hepática aguda e fibrose hepática 6. Em contraste com os modelos anteriormente descritos de inflamação e lesão, verificou-se que a produção de ROS no abdómen foi modestamente (cerca de 35%) aumentado em relação ao valor basal phox p47-/ - ratos a 4 h após a administração de CCl 4. No entanto, a magnitude de CCl 4 induzida por geração de ROS foi significativamente maior nos ratos do tipo selvagem do que nas p47 phox-/ - camundongos (Fig. 3-B). Estes dados sugerem que tanto a p47 phox contendo NADPH oxidase-dependente e independente de geração de ROS ocorrer em CCl 4 aguda induzida por dano hepático.
Figura 1. Produção de ROS em pulmões após tratamento zymosan. A) Representante bioluminescence de imagem de produção de ROS. Note-se que, em adição ao peito, a luminescência é detectável sobre o abdómen, tanto de tipo selvagem e p47 phox-/ - murganhos e luminescência abdominal é inalterado por tratamento zymosan. B) a contagem de fotões a partir da caixa de tipo selvagem e p47 phox-/ - murganhos depois de uma única injecção intratraqueal (IT) de zimosan. Imagem de bioluminescência foi realizada na linha de base, 4 h, e 24 h. A emissão de luz a partir da região de interesse sobre o tórax foi identificada utilizando a escala de pseudo cor-indicada. Os resultados são apresentados como média ± EP, n = 6-9 por grupo, * = p <0,05. clique aqui para ampliar a figura .
Figura 2. Detecção de ROS após CLP. A) imagem de bioluminescência Representante da produção de ROS, BFótons) conta a partir do peito, e conta C) de fótons do abdômen do tipo selvagem e p47 phox-/ - ratos na linha de base, 4 horas, e 24 horas após a CLP. Os resultados são apresentados como média ± EP, n = 4-5 por grupo, * = p <0,05. clique aqui para ampliar a figura .
Figura 3. Produção de ROS no abdômen após CCl 4 induzida por lesão hepática. A) imagem de bioluminescência Representante da produção de ROS e conta B) fótons do abdômen do tipo selvagem e p47 phox-/ - ratos na linha de base, 4 horas, e 24 horas após a administração oral CCl 4 tratamento. Os resultados são apresentados como média ± EP, n = 4-5 por grupo, * = p <0,05. figura clique aqui para ampliar .
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Discussão
"Em tempo real" de medição de espécies reactivas de oxigénio (ROS) em animais vivos pode ser conseguido através da utilização de sondas fluorescentes e quimioluminescentes. Enquanto sondas fluorescentes com fracos sofrem de sinal-para-ruído 12, a técnica de imagem descrito é mais sensível para a detecção de emissão de luz na sequência de uma reacção química de ROS com o substrato luminol baseada em L-012. Como todas as técnicas de imagiologia bioluminescentes, esta metodologia é limitada pelo compri...
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Divulgações
Não há conflitos de interesse declarados.
Agradecimentos
Este trabalho foi financiado pelo NIH RO1 AI079253 e do Departamento de Assuntos de Veteranos.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Nome do reagente | Companhia | Número de catálogo | Comentários |
| L-012 | Wako Chemicals EUA, Inc. | 120-04891 | |
| Zymosan | Sigma, St. Louis, MO | Z4250 | |
| tetracloreto de carbono | Sigma, St. Louis, MO | 289116 |
Referências
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Reimpressões e permissões
