Um método para a cultura de uma monocamada de células endoteliais em toda a superfície interior 3D inteiro de um dispositivo micro com microvascular de tamanho canais (= 30 mm) é descrito. Este In vitro Modelo microvasculatura permite o estudo das interacções entre as células biofísicas do sangue, células endoteliais, e factores solúveis em doenças hematológicas.
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Artigo de método
A microfluídica Endothelialized para estudo das interacções microvasculares em Doenças Hematológicas
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
Os avanços nas técnicas de microfabricação permitiram a produção de baixo custo e reprodutível sistemas microfluídicos para a realização de experiências biológicas e bioquímicas no 1,2 micro e nanoescala. Além disso, microfluídica também têm sido usados especificamente para analisar quantitativamente processos hematológicas e microvascular, devido à sua capacidade para controlar facilmente o ambiente dinâmico fluídica e condições biológicas 3-6. Como tal, os investigadores têm utilizado sistemas mais recentemente microfluídicos para estudar deformabilidade de células do sangue, a agregação de células sanguíneas, o fluxo sanguíneo microvascular, e sangue interacções célula-célula endotelial 6-13. No entanto, estes sistemas microfluídicos quer não incluem células endoteliais cultivadas ou eram maiores do que a correspondente sizescale para microvasculares processos patológicos. Uma plataforma microfluídica com cultura de células endoteliais que recapitula com precisão o celular, físico e hemodynambiente âmico da microcirculação é necessário para promover nossa compreensão da fisiopatologia subjacente biofísico de doenças hematológicas que envolvem a microvasculatura.
Aqui, apresentamos um método para criar uma "endothelialized" modelo in vitro da microvasculatura, usando um processo simples de microfabricação única máscara em conjunto com as técnicas de cultura de células endoteliais, estudar as interações patológicas microvasculares biofísicos que ocorrem na doença hematológica. Este "microvasculatura-on-a-chip", prevê o pesquisador, com um teor robusto que controla rigidamente biológica, bem como condições biofísicas e é operado através de uma bomba de seringa padrão e de campo claro / microscopia de fluorescência. Parâmetros como condições hemodinâmicas da microcirculação, tipo de célula endotelial, o tipo de células sanguíneas (s) e concentração (s), drogas / concentração inibitória etc, tudo pode ser facilmente controlada. Como tal, a nossa microsistema forneceum método para investigar quantitativamente processos de doença no qual o fluxo microvascular é prejudicada devido a alterações na adesão celular, agregação e deformação, uma capacidade disponível com os ensaios existentes.
Protocolo
1. Fabricação de microdispositivos o endotelial
- Criar um fotomáscara enviando um desenho assistido por computador (CAD) do dispositivo micro a um fornecedor máscara fora. A máscara utilizada foi composta de uma camada de cromo em refrigerante de vidro de cal. Neste caso, a largura do canal microfluídico foi de 30 uM.
- Limpar uma bolacha de silício nu com piranha (10:1 proporção de ácido sulfúrico e peróxido de hidrogénio) durante 15 minutos e mergulhar em ácido fluorídrico por 30 segundos. Lavar com água desionizada (DI) durante aproximadamente 10 segundos.
- Utilizando um revestidor de rotação, de spin Microchem SU-8 2025 fotorresiste sob....
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Discussão
O nosso sistema microdispositivo endothelialized é mais adequada quando usado em conjunção com as experiências in vivo, ea sua abordagem reducionista pode ajudar a elucidar os mecanismos biofísicos de processos hematológicas que são observadas em humanos e em modelos animais. Além disso, nosso sistema não é sem limitações. Por exemplo, os nossos canais microfluídicos são quadrados em corte transversal. Embora tecnicamente microcanais circulares podem ser fabricados 10,11, optou-se por recorr.......
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Divulgações
Não há conflitos de interesse declarados.
Agradecimentos
Agradecemos T. Hunt, M. Rosenbluth, eo Laboratório de Lam para os seus conselhos e discussões úteis. Agradecemos o apoio de G. Spinner e do Instituto de Eletrônica e Nanotecnologia do Georgia Institute of Technology. O apoio financeiro para este trabalho foi fornecida por uma subvenção NIH K08-HL093360, prêmio UCSF REAC, um Nanomedicina NIH Desenvolvimento Award Centro PN2EY018244 e financiamento do Centro de Biologia Celular endotelial de Saúde Infantil de Atlanta.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Nome do reagente | Companhia | Número de catálogo | Comentários |
| agulha ponto sem corte | OK Internacional | 920050-TE | Precision TE agulha calibre 20 x 1/2 ", cor de rosa |
| dextrano | Sigma-Aldrich | 31392 | |
| A fibronectina | Sigma-Aldrich | F0895 | |
| Furador (morsa pinos) | Inovações técnicas | ||
| As células endoteliais do cordão umbilical humana (HUVECs) | Lonza | CC-2519 | |
| Limpador de Plasma | Plasma | PDC-326 | |
| Polidimetilsiloxano (PDMS) | Fisher Scientific | NC9285739 | Sylgard 184 KIT Elastômero de Silicone |
| Sigmacote | Sigma-Aldrich | SL2 | |
| SU-8 2025 | Microchem | Y111069 | |
| SU-8 Desenvolvedor | Microchem | Y020100 | |
| Bomba de seringa | Harvard Apparatus | 70-3008 | PHD-ULTRA |
| tubagem (maior) | Cole-Parmer Instrument Company | 06418-02 | Tygonreg tubulação microboro, 0,020 "x 0,060 ID" OD |
| tubagem (menor) | Cole-Parmer Instrument Company | 06417-11 | PTFE tubulação microboro, 0,012 "x 0,030 ID" OD |
Referências
- Mezzano, D., Quiroga, T., Pereira, J. The Level of Laboratory Testing Required for Diagnosis or Exclusion of a Platelet Function Disorder Using Platelet Aggregation and Secretion Assays. Semin. Thromb. Hemost. 35, 242-254 (2009).
- Young, E. W. K., Beebe, D. J.
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Reimpressões e permissões
