Real-time Digital Imaging de leucócito-endotélio Interação em isquemia-reperfusão (IRI) do músculo cremaster de rato

Resumo

Microscopia de epifluorescência intravital Digital de vênulas na microcirculação cremastérico é um método conveniente para obter insights sobre leucócito-endotelial interação In vivo Na isquemia-reperfusão (IRI) do tecido muscular estriado. Nós aqui fornecer um protocolo detalhado para executar com segurança a técnica e discutir suas aplicações e limitações.

Resumo

Isquemia-reperfusão (IRI) tem sido implicado em uma grande variedade de condições patológicas tais como acidente vascular cerebral, enfarte do miocárdio, isquemia intestinal, assim como após o transplante, e cirurgia cardiovascular. ¹ reperfusão do tecido isquémico anteriormente, enquanto essencial para a prevenção de irreversível lesão tecidual, elicia inflamação excessiva do tecido afectado. Adjacente à produção de espécies reactivas de oxigénio, activação do sistema do complemento e aumento da permeabilidade microvascular, a activação de leucócitos é um dos agentes princípio na cascata patológico do dano tecidual inflamatória durante a reperfusão. ^{2, 3} activação dos leucócitos é um processo em várias etapas consistindo de laminagem, adesão firme e transmigração e é mediada por uma interacção complexa entre moléculas de adesão, em resposta a chemoattractants tais como factores do complemento, quimiocinas, ou factor de activação de plaquetas. ⁴ <p = classe "jove_content"> Enquanto circulante de leucócitos em vénulas pós-capilares é predominantemente mediado pela interacção das selectinas ⁵ com os seus ligandos de balcão, adesão firme dos leucócitos ao endotélio é-selectina controlada através da ligação a moléculas de adesão intercelular (ICAM) e celular vascular As moléculas de adesão (VCAM). ^{6, 7}

Padrão-ouro para a observação em vivo de leucócito-endotelial interação é a técnica de microscopia intravital, descrita pela primeira vez em 1968 ^8.

Embora vários modelos de IRI (isquemia-reperfusão) têm sido descritos para vários órgãos, ^9-12 apenas poucos são adequados para a visualização directa do recrutamento de leucócitos no leito microvascular em um elevado nível de qualidade de imagem. ⁸

Nós aqui promover a microscopia de epifluorescência intravital digitais da vênula postcapillary na microcirculação cremastéricodo rato ¹³ como um método conveniente para qualitativamente e quantitativamente analisar o recrutamento de leucócitos para a pesquisa IRI-no tecido do músculo estriado e fornecer um manual detalhado para a realização da técnica. Nós ilustrar ainda mais as armadilhas comuns e fornecer dicas úteis que deverão permitir ao leitor a apreciar verdadeiramente, e executar com segurança o método.

Em um passo a passo protocolo que descrevem como começar com anestesia respiração controlada sob monitorização suficiente para manter o animal anestesiado com firmeza por longos períodos de tempo. Em seguida, descrevem a preparação cremastérico como uma folha fina e plana para a resolução óptica surpreendente e fornecer um protocolo para imagiologia de leucócitos no IRI que tem sido bem estabelecidas nos nossos laboratórios.

Protocolo

1. Anestesia e Monitorização

1. Apropriadas ética nacionais e institucionais devem estar no local antes de realizar experimentos com animais. Após a aprovação do Comitê de Ética anestesiam ratos machos Sprague Dawley com peso de 120-180 g. Entregar 2 - 3% vol isoflurano a uma caixa de acrílico através de vaporizador de isoflurano e coloque dentro de rato.
2. Logo que o nível adequado de anestesia é alcançado (falta de reacção ao dedo do pé ou pitada cauda) no rato é pesado e raspada na área ventral cervical.
3. Colocar o rato em decúbito dorsal sobre uma almofada de aquecimento para manter a temperatura corporal a 37 ° C e aplicar isoflurano em 2% vol usando uma máscara de silicone.

As etapas de preparação que se seguem são melhor realizada usando um microscópio cirúrgico.

4. Para a preparação da traqueia, a artéria carótida ea veia jugular, executar uma incisão na pele 2 centímetros horizontal na área of fúrcula e mobilizar as glândulas salivares lateralmente.
5. Você agora enfrentam os músculos do pescoço ventral. Com cuidado, separe-os na linha média e encontrar a traquéia. Exponha 1 - 2 cm da traquéia e coloca uma pinça micro sob ele, de modo a levantá-lo.
6. Agora cortar a meio do lado ventral da traquéia. Tenha cuidado para não cortar todo o caminho, se você fizer isso, o corte final da traquéia vai escorregar de volta para o peito e ser muito difícil de trabalhar.
7. Inserir um tubo Abbocath (14G), utilizado como tubo traqueal para a parte inferior da traqueia, a qual tenha sido previamente ligado a um ventilador animal. Dica: fixação firme em grampos magnéticos, bem como a sutura da traquéia ao redor do tubo é essencial para manter o tubo traqueal no local. Geralmente usamos Terylene 5/0 de sutura, o material da sutura no entanto semelhante pode ser usada.
8. A respiração pode ser controlada a volume (freqüência, 35 - 45 respirações por minuto, volume corrente, 4,5 - 5 ml; FiO ₂ , 0,35-0,50;. isoflurano 1,5-2% vol) ¹⁴ Atelectasia pode ser evitada através da manutenção de um expiratória final positiva pressão de 5 a 10 mm _de H2O ¹⁵
9. Para a canulação da carótida, o músculo esterno-direito é separado por dissecção romba para localizar a artéria carótida.
10. Separe cuidadosamente o nervo vago a partir da artéria carótida e da artéria em montar uma pinça angulada micro para parar o sangue que flui do coração.
11. Passar duas peças de comprimento igual de sutura sob a artéria carótida. Em referência ao coração, a sutura mais distai está ligada firmemente para ocluir sangue que flui a partir da região da cabeça enquanto que a sutura proximal está ligado frouxamente em torno da artéria carótida.
12. Utilizando uma tesoura micro um pequeno corte é feito na artéria carótida entre as duas ligaduras.
13. Inserir um cateter de polietileno (0,28 mm de diâmetro interno) cheio com solução salina normal, que está ligado a um transdutor de pressão.
14. Remove a pinça micro e fios o cateter ainda mais para dentro da artéria. Em seguida, aperte a ligadura proximal ao redor da artéria e cateter. Dica: A aplicação de uma segunda sutura proximal impede o sangramento após a retirada da pinça micro.
15. Amarre a ligadura distal ao redor da carótida eo cateter para ancoragem adicional.
16. Monitorar a anestesia continuamente pela taxa de monitorização cardíaca e da pressão arterial. Realizar intermitentes análises de sangue arterial de gás utilizando um analisador de gás do sangue. ¹⁶ Uma taxa cardíaca inferior a 300 batimentos por minuto ou superior a 360 batimentos por minuto, bem como uma queda de pressão arterial média inferior a 80 mmHg durante mais de 5 minutos são critérios para exclusão. ^{17, 18} Manter sangue pH dentro dos limites fisiológicos (7,35 - 7,45). No caso do experimento deve ser finalizado devido a taxas anormais de monitoramento, escarificar o animal por deslocamento cervical ou exanguation.

Para a aplicação intravenosa de corantes fluorescentes ou outros fármacos óf interesse, faça o seguinte:

17. Concentre a área da veia jugular esquerda com o microscópio cirúrgico.
18. Com uma pinça em cada mão, rasgar a fáscia fina para revelar a veia jugular. Monte a veia em uma pinça de ângulo micro. O fluxo de sangue, então, parar.
19. Usando uma pinça, duas peças de comprimento igual de sutura são passados ​​sob a veia jugular concordante com a canulação da carótida. Amarre a sutura distal bem como a sutura proximal frouxamente em torno da veia jugular.
20. Fazer um pequeno corte na veia jugular e inserir um cateter de polietileno (0,28 mm de diâmetro interno) que foi lavada com solução salina. Marcar que incisão e canulação pode ser mais exigente e demorado do que a da carótida.
21. Passe o cateter para o coração e apertar a ligadura mais próximo do coração em torno da veia e do cateter.
22. Depois de permeabilidade conforme, amarre ligadura distal ao redor do cateter. Dica: fixação adicional de boª cateteres com fita pode impedir o deslocamento.
23. Lavar cateteres com freqüência para evitar a coagulação intraluminal.

2. Preparação do músculo cremaster

1. Nós usamos um estágio de alumínio de 1,5 - 2 cm de espessura para imagens cremastérico. A fase rapidamente adopta a temperatura desejada da almofada de aquecimento assim aliviando controlo térmico do tecido cremastérico. Isso é fundamental para estudos de inflamação. Alternativamente, uma plataforma de Plexiglas podem ser utilizados embora a regulação da temperatura cremastérico é mais difícil. Coloque o escroto no centro da fase.
2. A incisão inicial é feita na pele e fáscia espermática externa acima do escroto no final distal seguido de dilatação cuidado com o espaço subcutâneo com uma tesoura fina. Evite tocar o tecido subjacente com os instrumentos.
3. Logo que o tecido é exposto é humedecido com pré-aquecido (37 ° C) solução salina tamponada com fosfato wicálcio e magnésio th. Aplicar a solução regularmente para qualquer tecido exposto.
4. O tecido conjuntivo entre a fáscia espermática externa eo músculo cremaster é cuidadosamente removida para liberar o músculo cremaster do tecido circundante.
5. A superfície exterior do músculo cremaster é, então, cautelosamente limpo de tecido conectivo. Superfusão contínua durante hidratos de dissecação do tecido conjuntivo, facilitando a visibilidade e remoção.
6. Suturar a extremidade distai do saco cremaster para segurar para baixo e ligeiramente estender a extremidade do saco.
7. Faça uma incisão na extremidade distal do saco na face ventral e alongar a incisão proximalmente com uma tesoura micro. Cuidadosamente cauterizar vasos sangrantes ao longo das linhas de incisão utilizando um termo-cautério. Evite a cauterização desnecessária para limitar adicionais estímulos inflamatórios. Dica:. Dinâmica do fluxo sanguíneo perto da periferia da preparação são alterados por este dano tecidual ¹⁹ Portanto, para minimizar oSE afecta a recolha de dados, os vasos sanguíneos, perto do centro da preparação deve ser usado para geração de imagens.
8. O cremaster aberto fica encostado ao pedestal de alumínio embora ainda ligados por um ligamento fino para o epidídimo debaixo do testículo. Refletindo o testículo de um lado expõe esse ligamento, incluindo uma pequena artéria e veia que liga ao epidídimo. Use o cautério para selar os vasos e empregar as tesouras micro para cortar o ligamento conectivo entre testículo e tecido cremastérico.
9. Com cuidado, empurre de volta ao testículo isolado dentro do canal inguinal. Outros autores ressecção do testículo após a ligadura proximal (orquiectomia), juntamente com a almofada de moda associada inguinal ^20. Em um modelo sensível como IRI ativação induzida leucócitos tentamos evitar todos os estímulos adicionais cirúrgicos, portanto, abster-se de ressecção do testículo, que normalmente não é necessária para obter uma exposição suficiente do músculo cremaster.
10. Além da primeirasutura de fixação quatro arestas de tecido (duas de cada lado) e unem os segmentos para fitas a cautelosamente espalhar o tecido cremastérico radialmente sobre a fase de alumínio. Deixando uma lacuna entre o estágio de alumínio e entrada externa do canal inguinal simplifica recorte cremastérico subseqüente para isquemia.
11. Coloque duas extremidades do cateter de polietileno (0,28 mm de diâmetro interno) próximo ao tecido cremastérico para a configuração superfusão. Assegure-se que o lúmen é livre de ar para evitar bolhas de ar na câmara de fluido eventual.
12. Desenhar uma linha de vaselina (vaselina) em torno do músculo cremaster usando uma seringa. A linha deve estender-se o tamanho da lâmina de cobertura que é usado para a cobertura.
13. Para criar uma câmara de fluido, colocar uma lamela quadrado (32 × 32 mm) sobre o tecido cremastérico e firmemente ligar as pontas para a linha de vaselina.
14. No caso de o tecido não está cremastérico superfused com uma droga específica, a substituição contínua da gripe circundanteID não é essencial. Uma única aplicação de solução salina tamponada com fosfato com cálcio e magnésio para dentro da câmara criada pode então ser suficiente. Estimulação local com drogas no entanto deve ser realizada de forma contínua através de micro-perfusão bomba a uma taxa de 3 ml por hora.
15. O tecido cremastérico está agora pronto para a imagem latente microscópica.

3. Configuração intravital

A configuração básica intravital pode variar. Para imagens de epifluorescência, os experimentos devem ser executados em um quarto escuro.

1. O animal é transferida para o estágio de um microscópio de epifluorescência intravital equipado com um LED 470 nm fonte luminosa para epi-iluminação. Usar uma objectiva de imersão em água (20 × / 1,0) para atingir a ampliação de cerca de 800 ×. Registre as observações por meio de uma câmera de alta resolução digital e armazenar registros em um computador pessoal para avaliação off-line.
2. Para a rotulagem de leucócitos, injetar rodamina6G por via intravenosa através do cateter jugular em concentrações de 0,4 peso corporal mg / kg.
3. Escolha uma vênula postcapillary para observação. Tamanho do vaso deve variar entre 20-60 mM e fluxo de sangue deve ser suficiente. Para minimizar a influência da pré-activação do tecido, apenas os vasos em que rolamento de leucócitos é inferior a 20 cells/30 segundo e do número de células aderentes <10 cells/200μm de endotélio venular podem ser utilizados para análise posterior.
4. Se possível, até três vénulas pós-capilares podem ser utilizados para observação, contudo eles devem estar localizado numa secção correspondente do tecido cremastérico para evitar confusão dos vasos em pontos de tempo diferentes.

4. Isquemia-reperfusão (IIR)

1. Deixe tecido estabilizar durante 30 minutos.
2. Realizar uma gravação de 30 segundos para estabelecer os valores basais de rolamento de leucócitos e aderência. Idealmente, gerar um total de três gravações basais para verificar celularnúmeros e para obter desvios-padrão.
3. Suavemente colocar um clipe vaso Biemer em torno da extremidade proximal muito do tecido exposta cremastérico usando os fórceps de aplicação. Estase deve ocorrer imediatamente e pode ser visualizada por microscopia de epifluorescência na secção do vaso observada.
4. Uma variedade de cursos de tempo podem ser utilizados dependendo do nível de prejuízo requeridos. Nós aplicamos 30 minutos de tempo de isquemia, como descrito por outros autores. ^21-23 Retire o grampo navio depois. Permitir fluxo de sangue para estabilizar durante mais 15 minutos.
5. Gravações subsequentes de 30 segundos de duração pode ser feita ao longo do período de reperfusão (por exemplo, 30 segundos cada 15 minutos). Guarde as gravações digitalmente para análise offline.
6. Para o fim da experiência, o rato é sacrificado por deslocamento cervical, sob anestesia suficiente premindo um instrumento rombo, tais como a borda monótona de uma lâmina de tesoura na base do crânio. Com a outramão, a base da cauda é rapidamente puxado, causando a separação das vértebras cervicais a partir do crânio.

5. Análise reprodução offline Vídeo

1. Para análise offline reprodução de vídeo é útil para usar o software que permite a seleção de imagens distintas e observação da seqüência de vídeo em câmera lenta. Ajuste o contraste eo brilho de forma adequada. Usamos software fornecido pelo fabricante do microscópio que permite medições de comprimento e de ampliação digital.
2. Para a quantificação do rolamento de leucócitos, definem uma linha virtual que intersecta o vaso verticalmente que é consistente em todos os registos. Contar o número de leucócitos de rolamento que passam a linha dentro de 30 segundos manualmente.
3. Para a quantificação dos leucócitos aderentes, definem uma secção do vaso 200 iM que é consistente em todos os registos ²³ Contar o número de leucócitos claramente visíveis que permanecem estática durante 30 segundos -. Assim definidoresed como aderentes ^24.

6. Os resultados representativos

IRI do músculo cremaster não tem nenhum efeito sobre a pressão arterial média (MAP), a frequência cardíaca eo pH do sangue

Utilizando a configuração acima mencionada (Figura 1), foi investigada a microcirculação em IRI ao longo de um protocolo de duas horas, no entanto um tempo de observação muito mais tempo até 6 horas é possível. Como mostrado na Figura 2, o IRI do músculo cremaster não tem efeitos significativos sobre a circulação macrohemodynamic rato como a pressão arterial média e da frequência cardíaca permanecer estável durante todo o período de investigação. Além disso, monitoramos homeostase por meio de medições freqüentes do pH do sangue arterial, que variaram dentro dos limites fisiológicos e não mostrou significativas entre grupos de diferenças.

IRI induz rolamento de leucócitos na circulação cremastérico

Interação endotelial de leucócitos é uma chaveevento na inflamação aguda. Por meio de microscopia intravital foi observado um aumento dependente do tempo no número de leucócitos de rolamento em IRI do músculo cremaster (Figura 3A) concordantes com os dados anteriores ^{21, 25.} Rolamento montado sobre o tempo de observação de duas horas para um máximo de 137,63 ± 22,55% do valor de linha de base após 120 minutos de tempo de reperfusão e, em seguida, atingiram significância estatística em comparação com animais operação simulada (137,63 ± 22,55 vs 99,43 ± 14,04% do valor de linha de base).

IRI induz a adesão de leucócitos na circulação cremastérico

Para a avaliação adicional de leucócito-endotelial interacção analisamos a adesão de leucócitos em uma secção do vaso 200 uM. IRI induziu um aumento no número de leucócitos aderentes que excedeu significativamente os valores de operação simulada animais após 60 minutos (118,33 ± 6,83 vs 96,27 ± 5,78% do valor de linha de base) e ainda mais ASCEnded por 120 minutos de reperfusão (Figura 3B).

Em resumo, o descrito no modelo in vivo fornece dados consistentes de ativação leucocitária aguda em IRI sobrevivência animal, enquanto a circulação ea estabilidade é garantida.

Figura 1. A. Fluxograma para o desempenho de microscopia de epifluorescência intravital na isquemia-reperfusão do músculo cremaster de rato. Após os preparativos necessários para anestesia e monitoramento, o músculo cremaster de rato é exposto para a imagem latente. Registros de ativação leucocitária são tomadas antes e depois da isquemia tecidual. Análise de vídeo subsequente é melhor executada offline. B. Figura esquemática da configuração proposta intravital. Clique aqui para ver maior figura .

Figura 2. IRI do músculo cremaster não tem nenhum efeito sobre a pressão arterial média (MAP), ritmo cardíaco e pH do sangue. A pressão arterial média (A) e da frequência cardíaca (B) foram monitorizados a cada 30 minutos durante toda a experiência através de transdutor de pressão após canulação da direita da artéria carótida. A medição do pH do sangue arterial-(C) foi realizada após 0, 60 e 120 minutos. Valores são média ± EPM de 6 animais diferentes, variando em níveis fisiológicos, sem diferenças significativas inter-grupos. Clique aqui para ver maior figura .

Figura 3. IRI aumenta leucócitos-Endotelial interacção na circulação cremastérico. Após marcação de leucócitos com rodamina 6G (0,4 peso corporal mg / kg) microscopia de epifluorescência intravital foi utilizado para determinar leucócito-endotelial de interacção em lesão de reperfusão através de um protocolo minutos 120 após 30 minutos de isquemia de tecido. Registos foram tomadas a ampliação de cerca de 800 ×. A. IRI aumenta significativamente o número de leucócitos de rolamento em vénulas pós-capilares do músculo cremaster por 120 minutos de reperfusão Considerando rolamento de leucócitos permanece estável ao longo da experiência no tecido cremastérico que não foi submetido a isquemia. Os valores são média ± SEM de 6 ratos observados. # P <0,05 utilizando o teste t não emparelhado. B. O número de leucócitos aderentes é significativamente aumentada em uma secção do vaso escolhido aleatoriamente 200μm postcapillary após 30 minutos de isquemia cremastérico e subsequentes 60 minutos de reperfusão do tecido. Resultados ficar ainda more pronunciado após um período de reperfusão de duas horas. Os valores são média ± SEM de 6 ratos observados. # P <0,05 utilizando o teste t não pareado. Imagens representativas C. de uma vênula postcapillary antes da isquemia (esquerda) e 120 minutos após o IRI (direita). Clique aqui para ver maior figura .

Discussão

Leucócito-endotelial interacção, a produção de espécies reactivas de oxigénio e de activação do sistema do complemento são as principais características de IRI induzida por disfunção do tecido. ²⁶ microcirculação A do tecido afectado é considerado como o local integral para o início inflamatória. Para além de experimentações ex vivo, tais como ensaios de câmara de fluxo ^{27, 28,} é obrigatória a existência de modelos bem-estabelecidos de imagem intravital para avaliar melhor a relevância

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Nome do equipamento:	Empresa:	N º de Catálogo:	Comentários:
Forene 100% (V / V)	Abade	B506	API isoflurano
Terylene Sutura	Serag Weissner	OC108000
Portex fina Diâmetro Tubos de polietileno	Smiths Medical	800/100/100	0,28 mm de diâmetro interno
0,9% de solução salina	Fresinus Kabi	808771
Mudanças-A ponta de luxo kit cauterização	Bovie Medical	DEL1
Abbocath-T 14G	Venisystems	G713- A01	utilizado como tubo de lente
Ventilador Servo 900C	Maquet		utilizado como ventialtor animais
Transdutor de pressão lógico	Smiths Medical	MX1960
Sirecust 404 monitor	Siemens
ABL 700 bancada Analyzer	Radiômetro		para medição de gás de sangue
Almofada de aquecimento	Effenberger	8319
Estágio de alumínio	Alfun	AW7022
Microscópio cirúrgico OPMI 6-SDFC	Carl Zeiss
Microcirúrgica instrumentos de laboratório set	S & T	767
Biemer clipe de navio	Diener	64,562
Aplicando fórceps	Diener	64,568	para Biemer clipe de navio
Rodamina 6G	Sigma-Aldrich	R4127
Vaseline branco DAB	Winthrop	2726853
Cubra óculos			32x32 milímetros
			Configuração intravital
Zeis Axio Scope A-1 MAT	Carl Zeis	490036	microscópio de epifluorescência
470 nm LED	Carl Zeis	423052	fonte de luz de fluorescência
Colibri Sistema 2	Carl Zeis	423052
W Plano Apochromat-20x / 1,0 DIC	Carl Zeis	421452	objetiva de imersão de água
AxioCam MRM Rev. 3 FireWire	Carl Zeis	426509	de alta resolução da câmera digital
Axio LE visão software	Carl Zeis	410130	utilizar para análise offline