Um parasita Ensaio de Resgate e Transformação de Triagem leishmanicida contra intracelular<em> Leishmania donovani</em> Amastigotas em THP1 linha celular humana aguda Monocytic Leucemia

Summary

Um ensaio de parasita resgate e transformação com células infectadas THP1<em> In vitro</em> Com<em> Leishmania donovani</em> Foi otimizado para anti-leishmaniose triagem de drogas. O ensaio envolve a diferenciação de células THP1, a infecção com promastigotas, o tratamento com medicamentos de teste, na lise controlada dos macrófagos infectados, resgate de amastigotas, transformação de promastigotas e crescimento e proliferação de promastigotas de monitorização com um ensaio fluorimétrico.

Abstract

A leishmaniose é uma das doenças mais negligenciadas do mundo, em grande parte afetando os mais pobres dos pobres, principalmente em países em desenvolvimento. Mais de 350 milhões de pessoas são consideradas em risco de contrair a leishmaniose, e cerca de 2 milhões de novos casos ocorrem ^um ano. Leishmania donovani é o agente causador da leishmaniose visceral (LV), a forma mais fatal da doença. A escolha de drogas disponíveis para tratar a leishmaniose é limitada ^2; tratamentos actuais proporcionam uma eficácia limitada e muitos são tóxicos nas doses terapêuticas. Além disso, a maioria das drogas de primeira linha de tratamento já perderam a sua utilidade, devido ao aumento da resistência a múltiplas drogas ^3. O gasoduto atual de anti-Leishmania drogas também é severamente reduzida. São necessários esforços continuados para enriquecer um novo anti-leishmaniose oleoduto de descoberta de drogas, e este esforço depende da disponibilidade de modelos adequados de rastreio in vitro.

<p class = "jove_content"> Em promastigotas in vitro e ensaios ⁴ axênicas amastigotas ^cinco são utilizados principalmente para anti-leishmaniose triagem de drogas no entanto, pode não ser adequado devido a importantes celulares, diferenças fisiológicas, bioquímicas e moleculares em comparação com amastigotas intracelulares. Ensaios com macrófagos amastigotas modelos são considerados mais próximo das condições fisiopatológicas de leishmaniose, e são, portanto, o mais apropriado para a avaliação in vitro. Diferenciadas, não-humanos que dividem as células de leucemia aguda monocíticas (THP1) (faça um atraente) Em alternativa à isoladas macrófagos primários e podem ser utilizados para ensaiar a actividade anti-Leishmania de diferentes compostos contra amastigotas intracelulares.

Aqui, apresentamos um ensaio parasita resgate e transformação com diferentes THP1 células infectadas in vitro com Leishmania donovani para a seleção de compostos puros e naturais prodtos extractos e determinação da eficácia contra as formas amastigotas de Leishmania intracelulares. O ensaio envolve os seguintes passos: (1) a diferenciação de células THP1 em que não se dividem macrófagos, (2) a infecção de macrófagos com L. donovani promastigotas metacíclicas, (3) tratamento de células infectadas com os medicamentos de teste, (4) a lise controlada de macrófagos infectados, (5) A libertação / salvamento de amastigotas e (6) transformação de formas amastigotas de promastigotas vivos para. O ensaio foi optimizada utilizando tratamento com detergente para a lise controlada de infectados por Leishmania THP1 células para alcançar salvamento quase completa de formas amastigotas viáveis ​​com um efeito mínimo sobre a sua capacidade de transformar a promastigotas. Macrófagos diferentes relações entre promastigotas foram testados para alcançar infecção máxima. Quantificação da infecção foi realizada por meio da transformação de vida, resgatados Leishmania amastigotas para promastigotas e avaliação de seu crescimento por uma alamarBlue ensaio fluorométrico, em microplacas de 96 poços. Este ensaio é comparável ao actualmente usado microscópico gene repórter, transgénicos e digitais-imagem ensaios de análise. Este ensaio é robusto e mede apenas os amastigotas intracelulares vivos em relação ao gene repórter e ensaios de análise de imagem, que não podem diferenciar entre os amastigotas vivos e mortos. Além disso, o ensaio foi validado com um painel de corrente de anti-Leishmania drogas e tem sido aplicado com sucesso em grande escala de triagem de compostos puros e de uma biblioteca de fracções de produtos naturais (Tekwani et al. Não publicado).

Protocol

1. Manter e Subculture THP1 Cultura de Células

1. THP1 manter as células em meio RPMI-1640 (com 10% de FBS e pH 7,4) a 37 ° C em 5% de uma incubadora de CO _2.
2. Células de subcultura duas vezes por semana para evitar a contagem de células a partir de superior a 1×10 ⁶ células / ml. Isto é importante para manter a sua capacidade de transformação.

2. Manter e Subculture Leishmania donovani promastigotas Cultura

1. Manter a L. donovani promastigotas (S1, estirpe sudão) em meio RPMI-1640 (sem bicarbonato de sódio e piruvato de sódio) com 10% de FBS a 26 ° C.
2. L. subcultura donovani promastigotas duas vezes por semana, com a mais alta concentração de células na gama de 20-25×10 / ⁶ promastigotas ml.Caution: Todos os meios e soluções deve ser levado à temperatura ambiente antes do uso.

3. Sementeira e diferenciação das células THP1 em um 96 poços de microplacas de 16 e câmara de slides Cultura vidro.

1. Prepara-se uma cultura THP1 diluída com a contagem de células de 2.5×10 ⁵ células / ml a partir de uma cultura de células de quatro dias de idade (número de células não deve exceder 10 ⁶ células / ml) em meio RPMI-1640 com 10% de FBS inactivado pelo calor. Preparado 20 ml de cultura de cada placa de 96 poços e 4 ml da cultura para cada lâmina câmara 16 poços.
2. Adicionar forbol 12-miristato 13-acetato (PMA) (para a diferenciação de THP1) a uma suspensão diluída de células de cultura (10 ml de cultura μl/20 partir do stock de 50 mg / ml em DMSO) (concentração final de PMA em cultura de células diluída deve ser 25 ng / ml).
3. Para comparar a Digital-Imagem-Análise-Direct-Contagem-Ensaio e Parasite-Rescue-Transformação de Ensaio, configurar os ensaios simultaneamente em claro, de fundo plano, placa de 96 poços e 16 câmaras, vidro, slide cultura microscópica.
4. Pipetar 200 ul de células THP1-PMA-tratados para cada cavidade ou câmara.
5. Incubar a p 96 poçoslates e slides 16 poços numa câmara de 37 ° C, 5% CO ₂ incubadora durante a noite para permitir a diferenciação quase completa das células.

Nota: As células THP1, que normalmente crescem em suspensão, são diferenciadas em macrófagos aderentes.

4. Infecção das células transformadas THP1 com promastigotas de Leishmania donovani

1. Para a infecção da cultura de células THP1 diferenciadas com promastigotas Leishmania donovani, a maioria dos parasitas deve estar na fase metacíclico infecciosa (formas cilíndricas longas, a cultura ~ 5-6 dias de idade).
2. Uma célula THP1 1:10 a relação parasita é ideal para a infecção tanto no Digital Image Analysis-Direct-Contagem-Ensaio e promastigota-Rescue-Transformação de Ensaio.
3. Prepara-se uma cultura diluída de L. donovani promastigotas do parasita com uma contagem de 2.5×10 ⁶ parasita / ml (para células THP1: proporção = 1:10 parasitas) deuma cultura de 5-6 dias de idade em meio RPMI-1640 com 2% de FBS.
4. A partir do passo 3.5 (após a diferenciação durante a noite de cultura de células THP1) retirar as placas e lâminas de câmara, remover o meio e lava-se as culturas de células uma vez com soro isento de meio RPMI-1640.
5. Após lavagem cuidadosa de PMA-tratado com células THP1 isento de soro, morno RPMI-1640 (~ 37 ° C) média, substituir o meio isento de soro com 200 uL da cultura diluída de L. donovani promastigotas (2.5×10 ⁶ parasitas / ml) do passo 4.3. Configurar os poços de controlo de células THP1 sem o parasita e os parasitas sem THP1 células em cada placa e as lâminas 16 poços de câmara.
6. Após a adição de parasita para a cultura de células THP1, incubar a placa e as lâminas a 37 ° C, 5% CO ₂ por 24 horas para permitir que os parasitas que infectam os THP1 diferenciadas células.

5. O tratamento de macrófagos infectados com drogas de ensaio / Compostos

1. TesteAnfotericina B, pentamidina e Miltefosina como padrão anti-Leishmania drogas para a seleção. Preparam-se soluções de estoque dos compostos de teste de drogas / em água ou DMSO, como mencionado na tabela reagente. Testar cada composto a 6 concentrações de droga.
2. Seriadamente diluído (1:5), as drogas padrão e compostos de teste numa placa de 96 poços, frescas ou tubos de 2 ml (para lâminas de câmara) com meio RPMI-1640 com 2% de FBS. Os medicamentos / concentrações de composto de teste neste prato são 2X de concentrações finais.
3. Lavar as placas de cultura e lâminas de câmara infectados com L. promastigotas donovani (a partir do passo 4.5), pelo menos, 5 vezes com soro isento, meio RPMI-1640. Adicionam-se 100 ul de meio de cultura (RPMI-1640 com 2% de FBS) em cada poço / câmara. As lavagens múltiplas são necessárias para assegurar a completa remoção de não-internalizadas promastigotas.
4. Adicionam-se 100 ul de meio de seriadamente diluídas padrão anti-Leishmania drogas ou os compostos de teste a cada poço ou câmara. Configure a infecçãoted células THP1 controla sem drogas, simultaneamente, em cada placa deslizante / câmara.
5. Incubar as placas e lâminas de câmara a 37 ° C, 5% CO ₂ durante 48 horas.

6. Coloração Deslize Câmara, Imaging microscópio de fluorescência e Análise de Imagem para Quantificação de Infecção e Efeito de Tratamento de Drogas

1. Após uma incubação de 48 horas, lava-se a câmara de corrediça 3 vezes com soro isento de meio RPMI-1640. Descasque as câmaras de plástico dos slides e consertar as células, mergulhando as lâminas em metanol por 30 seg. Deixe os slides em bio-capa sob o fluxo de ar para a secagem.
2. Prepara-se uma solução corante SYBR Green I (5X) por diluição (1:2000) no estoque (10.000 X) com água.
3. Coloração das lâminas, no escuro, com o verde SYBR diluída I mancha solução durante 15 min à temperatura ambiente, lava-se uma vez com água e deixar as lâminas sob o fluxo de ar para a secagem.
4. Coloque uma lamela de vidro cheio sobre o stained corrediça com a ajuda de meio de montagem.
5. Capturar as imagens digitais de células THP1: sem infecção (em branco), com a infecção (controlo), as células infectadas tratadas com diferentes fármacos padrão ou dos compostos de teste em diluições diferentes (Figura 3, 5 e 6)), utilizando um microscópio Nikon Eclipse 90I fluorescente acompanhado por elemento de software NIS 3,2 AR.
6. Contagem dos núcleos de macrófagos (grande) e os núcleos de parasita (pequeno com cinetoplasto) usando ImageJ (Figura 7), que é um publicamente disponível, baseado em Java programa de processamento de imagem desenvolvido no National Institutes of Health ( http://rsb. info.nih.gov / ij / download.html ). Expressar os dados como o número de amastigotas por 100 células transformadas THP1.

7. O Parasita-Rescue-Transformação-Ensaio: lise controlada de L. donovani Amastigotas Macrófagos infectados

1. Lava-se a microplaca de 96 poços a partir do passo 5,5 três vezes com soro isento de meio de cultura RPMI-1640.
2. Entre os detergentes diferentes testadas em diferentes concentrações, de 0,05% de tratamento de SDS durante 30 segundos é o ideal para a lise controlada (lise celular máxima, com perda mínima de viabilidade parasitas resgatados ').
3. Remover o meio isento de soro a partir de cada cavidade, após a última lavagem e adicionar 20 ul de meio RPMI-1640 (com 0,05% de SDS) a cada poço. Agitar a placa durante 30 segundos, e adicionar 180 ul completo RPMI-1640 (com FBS a 10%) a cada poço.
4. Incubar as placas a 26 ° C, durante 48 horas, para a transformação de amastigotas resgatados para promastigotas.

8. Análise Quantitativa de promastigotas Transformado (ensaio alamarBlue)

1. Após uma incubação de 48 h a 26 ° C, todas as formas amastigotas resgatados vivos são transformados em promastigotes (Figura 1D). Adicionar 10 ul de alamarBlue em cada cavidade da p 96 poçoslates.
2. Incubar as placas a 26 ° C durante a noite.
3. Após incubação durante a noite, ler as placas para fluorescência padrão num Fluostar Galaxy fluorímetro (BMG Lab Technologies) a 544 nm de excitação, 590 nm de emissão.
4. Preparar as curvas de dose-resposta (percentagem de crescimento em função da concentração do composto de fármaco ou de teste) com ExcelFit (Figuras 7-9) e IC de computação CI _50/90 valores de tais curvas (Tabela 1).

9. Padronização de THP1 Células à relação de Parasitos

1. Padronizar as células THP1 a proporção de parasitas para determinar a sensibilidade do ensaio. Nota: infecção Baixo / alto número parasitas / pode comprometer com sensibilidade e seletividade do exame.
2. Padronizar as células à razão de THP1 parasitas, seguindo o protocolo descrito acima para a sementeira de células THP1 e infecção por Leishmania promastigotes (secção 3 e 4) excepto o uso diffrácios erent de células THP1 em parasitas como 1:1,25, 1:2,5, 1:5 e 1:10.
3. Configure a experiência tanto na câmara de 16-slide (para análise de imagem) e placa de 96 poços (para parasita resgate ensaio) formatos para comparar o resgate parasita e ensaios de análise de imagem.

10. Padronização dos detergentes diferentes para a lise celular controlada

1. O principal objectivo desta experiência é para otimizar o protocolo para a lise controlada das células THP1 para alcançar o máximo / total THP1 lise células sem afetar significativamente a viabilidade dos parasitas amastigotas resgatados.
2. Testar diferentes detergentes, tais como Tween 20, Tween 80, Triton X-100, NP-40 e SDS em concentrações diferentes e durações de tratamento diferentes (Figura 2).
3. THP1 células à razão de parasitas é de 1:10 e de outras condições semelhantes como acima secções 1-8.
4. Teste a 0,05% SDS tratamento adicional para o tempo de tratamento diferentes para optimizar ainda mais a lise celular controlada.

Representative Results

Discussion

Há vários métodos disponíveis para os anticorpos anti-leishmaniose triagem de drogas baseadas em macrófagos amastigotas modelos. Os ensaios podem ser feitos com os macrófagos obtidos a partir de animais hospedeiros células de exsudado peritoneal (PEC nomeadamente), células de monócitos do sangue periférico (PBMC) ^{de 6} ou derivadas da medula óssea (BMM macrófagos) ou em linhas de células monocíticas, tais como o rato (J774 e RAW264.7 ) ⁷ e humano (THP1, U937, HL-60) ⁸ células monocíticas. Os ensaios, que utilizam células de divisão de acolhimento, deve assegurar que os efeitos de confusão da atividade de drogas em ambos parasita e hospedeiro número de células são consideradas. Os macrófagos diferenciados primários coletados de várias fontes, tais como camundongos e ratos são não-divisão na natureza, mas estas preparações celulares não pode ter populações de células homogêneas. As linhas de células monocíticas células-derivados são homogéneas na natureza e são um melhor modelo para a despistagem de macrófagos-amastigota-baseado. Fora de diferentes linhas de células monocíticas, diferentiated THP1 células (linha de células humanas de leucemia monocítica aguda) pode formar uma monocamada não estão em divisão e oferecem uma alternativa atraente aos macrófagos isolados primários.

O rastreio de macrófagos-amastigota baseada pode ser feito de várias maneiras. Avaliação microscópica clássica, baseada em célula direta e parasita contando ⁹ é um trabalho intensivo. A ausência de automação limita a utilidade deste ensaio. Contagem de células é demorado e pode dar determinação imprecisa de _valores de IC50 desde determinação da viabilidade do parasita por meio de um procedimento de coloração é difícil. Muitos corantes fluorescentes e os anticorpos monoclonais podem ser utilizados para ensaios de citometria de fluxo ^{10, 11,} mas estes testes também são limitados devido à menor sensibilidade e limitação do intervalo de tempo de fármaco para o tratamento de apenas um dia. Existem vários ensaios reporter genes disponíveis para quantificar o crescimento de formas amastigotas ^12,13,14. Uma máquina automáticaed rastreio pode ser possível usando genes repórter, mas estes testes também têm certas desvantagens. Primeiro, a maioria destes ensaios necessitam de selecção de drogas para a manutenção da expressão epissómica dos genes repórter, o que pode não ser ideal para uma experiência de rastreio de drogas. A maneira pela qual o gene repórter é introduzido também podem influenciar as propriedades fisiológicas do parasita e têm um impacto sobre a triagem. Se o gene repórter é a parte de um plasmídeo epissómico, a saída relativa do repórter pode depender do número de cópias do plasmídeo transfectado (que varia de célula para célula), em vez de sobre a actividade do fármaco ^14. Alguns parasitas repórter que são transformados parasitas não precisa de manter a pressão selectiva no gene repórter, no entanto, pode haver consequências biológicas ou por ruptura da arquitectura genómica ou apenas pela presença das proteínas repórter estranhos ^15. Em alguns ensaios de gene repórter com base, existemquestões de sensibilidade e de fundo atividade ^16. Mais importante, muitos dos ensaios de expressão do gene repórter, especialmente uma com a GFP repórter gene15, não podem diferenciar entre os amastigotas intracelulares vivos e mortos. Ensaios baseados em genes repórter da luciferase pode discernir entre vivas e mortas formas amastigotas, mas o substrato e tampão de lise de células para esses ensaios são caros em grande escala de triagem ^17. Para superar estes deméritos e as limitações de anteriores ensaios de rastreio para macrófagos amastigota-based, temos desenvolvido e optimizado neste ensaio parasita salvamento e de transformação. Este ensaio baseia-se em células THP1, que têm boa homogeneidade e são não se dividem na natureza, como células hospedeiras.

O ensaio Parasite-Rescue-Transformação-Ensaio aqui descrito é comparável ao ensaio baseado em Digital-Análise de Imagens-Direct-Contagem de amastigotas intracelulares. Microscopia de fluorescência e DIC, digital imagAs análises de e por ImageJ para contagem diferencial dos núcleos de macrófagos e os núcleos do parasita ainda mais refinado o ensaio de contagem, ao microscópio. Capturar as imagens em filtros de luz fluorescente e contraste de interferência diferencial (DIC) filtros melhoraram a qualidade da imagem digital para a contagem mais precisa dos parasitas intracelulares. Tanto imagens fluorescentes e DIC podem ser fundidas para obter as imagens digitais com contornos claros de macrófagos celulares e núcleos intracelular fluorescente. Os núcleos dos macrófagos e os núcleos parasita pode ser diferencialmente reconhecido com ImageJ. Portanto, tanto o Digital-Análise de Imagens-Direct-Contagem-Ensaio e Parasite-Rescue-Transformação-Ensaio têm o potencial para automação e aplicação em larga escala de triagem. Os passos críticos na Parasite-Rescue-Transformação Assay-se: (a) as lavagens repetidas de culturas de células THP1 após a exposição a formas promastigotas de Leishmania, para assegurar a remoção quase completa do estágio não-promastigotas institucionalizados e (b) a lise controlada das células infectadas com SDS THP1. Ambas as etapas podem também ser controlados com a automatização e não deve comprometer a taxa de transferência do ensaio. O segundo passo de lavagem, após a exposição das células infectadas por Leishmania THP1 para os medicamentos de teste / compostos remove os restantes não internalizadas parasitas, se houver. O Parasite-Rescue-Transformação Assay oferece vantagens significativas sobre os existentes gene repórter microscópico, e ensaios de análise de imagem. O ensaio é simples, robusta e reproduzível, pode ser automatizado de grande escala de triagem e, portanto, deve ter importante aplicação na triagem de grandes bibliotecas de compostos para a descoberta de novos medicamentos anti-leishmaniose. Além disso, o ensaio também pode ser aplicado para avaliar a infectividade do clínico, assim como, os isolados laboratoriais de Leishmania in vitro.

Materials

Phorbol 12-Myristate 13-Acetate (PMA)	Sigma-Aldrich USA	P1585	Required for differentiation of THP1 cells.
RPMI-1640 Medium	Invitrogen	23400021
Lab-TeK Chamber Slide System (16 Chamber)	Thermo Scientific Nunc	178599
Clear, Flat-Bottom, 96-Well Plates	BD Falcon	353075	Plates to perform 96-well plate assay
Amphotericin B	Sigma-Aldrich USA	A4888	Standard anti-leishmanial drug dissolve in DMSO (2 mg/ml)
Pentamidine Isothionate Salt	Sigma-Aldrich USA	P 0547	Standard anti-leishmanial drug dissolve in DMSO (2 mg/ml)
Miltefosine	EMD Biosciences USA	475841	Standard anti-leishmanial drug dissolve in serum-free RPMI-1640 medium (prepare fresh) (2 mg/ml)
Sodium Stibogluconate	EMD Biosciences USA	567565	Standard anti-leishmanial drug prepare in RPMI-1640 with 4% FBS. (1 mg/ml)
Sodium Dodecyl Sulfate	Sigma-Aldrich USA	L 5750
Fluorescence Microscope	NIKON	ECLIPSE 90i
Fluorescence Microplate Reader	BMG	Polar Star Galaxy
Mounting Medium	Sigma-Aldrich USA	M 1289
alamarBlue	AbD Serotec	BUF012 B
SYBR Green I	Sigma-Aldrich USA	S 9430
Sodium Bicarbonate	Fisher Sci.	523500
Sodium Pyruvate	Sigma-Aldrich USA	P2256
2-Mercapt–thanol	Sigma-Aldrich USA	M6250
Fetal Bovine Serum	Atlanta Biologicals	S11050H
Tween 20	Sigma-Aldrich USA	P9416
Tween 80	Sigma-Aldrich USA	P6474
Triton X-100	Sigma-Aldrich USA	T8787
NP-40	Calbiochem	492016