Mapeamento bacterianas redes funcionais e vias Escherichia Coli Usando sintéticos matrizes genéticas

Alla Gagarinova; Mohan Babu; Jack Greenblatt; Andrew Emili

doi:10.3791/4056

Artigo de método

Mapeamento bacterianas redes funcionais e vias Escherichia Coli Usando sintéticos matrizes genéticas

DOI:

10.3791/4056

⸱

12 de novembro de 2012

Alla Gagarinova^*¹ , Mohan Babu^*²^,³ , Jack Greenblatt¹^,² , Andrew Emili¹^,²

¹Department of Molecular Genetics, University of Toronto, ²Banting and Best Department of Medical Research, Donnelly Centre, University of Toronto, ³Department of Biochemistry, Research and Innovation Centre, University of Regina

^* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

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Sistemáticas e em grande escala genético sintético telas (gene-gene ou epistasia) interação pode ser usado para explorar a redundância genética e via de cross-talk. Aqui, descrevemos um alto rendimento quantitativo tecnologia de rastreamento genético sintético matriz, denominada eSGA que desenvolvemos para a elucidação de relações epistáticos e explorar redes de interação genéticos em Escherichia coli.

Resumo

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Fenótipos são determinados por uma série complexa de física (por exemplo, proteína-proteína) e funcionais (por exemplo, gene-gene ou genética) interacções (GI) ^1. Enquanto interações físicas podem indicar que as proteínas bacterianas estão associadas como complexos, eles não revelam necessariamente via de nível relationships1 funcionais. Telas de GI, em que o crescimento de mutantes duplos tendo dois genes eliminados ou inactivados é medida e comparada com os mutantes correspondentes individuais, pode iluminar dependências epistáticos entre loci e, portanto, proporcionam um meio para consultar e descobrir novas relações funcionais ^2. Mapas de grande escala GI foram relatados por organismos eucarióticos como o fermento ^3-7, mas a informação GI permanece escassa para procariontes ^8, o que dificulta a anotação funcional de genomas bacterianos. Para este fim, e outros desenvolveram alto rendimento quantitativo bacterianas métodos de rastreio de IG ^{9, 10} Aqui, apresentamos os principais passos necessários para realizar E. quantitativa coli Genetic Matriz Sintética procedimento de triagem (eSGA) em um genoma de ^escala-9, utilizando-se a conjugação bacteriana natural e recombinação homóloga para gerar sistematicamente e medir a aptidão de um grande número de mutantes duplos em um formato de matriz de colónia. Resumidamente, um robô é usado para transferir , através de conjugação, cloranfenicol (Cm) - marcado alelos mutantes de Hfr engenharia (alta freqüência de recombinação) 'linhagens doadoras em um conjunto ordenado de canamicina (Kan) - marcadas F-receptor cepas. Normalmente, usamos a perda de função de mutantes simples tendo deleções de genes não essenciais (por exemplo, a recolha de 'Keio' ¹¹⁾ e as mutações de genes essenciais hypomorphic (isto é, os alelos que conferem a expressão da proteína reduzida, a estabilidade, ou a actividade de ^{9, 12, 13)} para consultar as associações funcionais de genes essenciais e não essenciais, resvamente. Após a conjugação e subsequente troca genética mediada por recombinação homóloga, os duplos mutantes resultantes são seleccionadas em meio sólido contendo ambos os antibióticos. Depois de conseqüência, as placas são digitalmente fotografada e tamanhos colônia são quantitativamente registados com um sistema interno de tratamento automatizado de imagem ^14. IG são reveladas quando a taxa de crescimento de um mutante duplo ou é significativamente melhor ou pior do que ⁹ esperada. SIG (ou negativo) agravante muitas vezes resultam entre a perda de função de mutações em pares de genes de vias compensatórias que incidem sobre o mesmo processo essencial ^2. Aqui, a perda de um único gene é tamponada, tal que um ou outro mutante único é viável. No entanto, a perda de ambas as vias é prejudicial e resulta em letalidade sintética ou de doença (isto é, crescimento lento). Inversamente, aliviando (ou positivos) podem ocorrer interacções entre os genes na mesma via ou a proteína do complexo ^2, como odeleção de um ou outro gene sozinho é frequentemente suficiente para perturbar o funcionamento normal da via ou complexo de tal forma que as perturbações adicionais não reduzem a actividade, e, consequentemente, o crescimento adicional. No geral, a identificação sistemática e análise de redes de GI pode fornecer imparciais, mapas globais de relações funcionais entre um grande número de genes, dos quais via de informações em nível de perdida por outras abordagens podem ser inferidas ^9.

Protocolo

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1. Construção de cepas mutantes HFR Doadores Cavalli por Recombineering ^{15, 16}

Os passos para a construção dos corantes doadores eSGA são descritos abaixo. Resumidamente, usamos λ alvo - Red recombinação homóloga mediada ¹⁶ da cassete seleccionável amplificado de ADN marcador de fragmentos gerados por PCR, para criar não essenciais mutantes de deleção de genes (secção 1.1), ou de genes essenciais hypomorphic estirpes dadoras mutante (secção 1.2), que são então utilizados como "consultas" para definir redes GI.

Nota: Durante o processo de desenvolvimento....

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Resultados

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GIs revelam relações funcionais entre os genes. Da mesma forma, uma vez que os genes na mesma via exibem padrões GI semelhantes e a semelhança do perfil GI representa a congruência dos fenótipos, podemos agrupar genes funcionalmente relacionados em vias agrupando seus perfis GI. A integração de redes de correlação GI e GI com informações de interação física ou outros dados de associação, como relacionamentos de contexto genômico (GC), também pode revelar a organização de módulos funcionais de ordem superior que definem o.......

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Discussão

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Temos delineado um protocolo passo a passo para a utilização de triagem eSGA robótico para investigar funções de genes bacterianos em um nível caminho interrogando GI. Esta abordagem pode ser usada para estudar os genes individuais, bem como os sistemas biológicos inteiras em E. coli. Cuidadosamente executar as etapas experimentais descritas acima, incluindo todos os controles apropriados, e rigorosamente análise e validação dos dados de forma independente GI são aspectos fundamentais para o sucesso de eSGA em .......

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Divulgações

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Não há conflitos de interesse declarados.

Agradecimentos

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Este trabalho foi financiado por fundos do Genome Canada, o Instituto Ontário Genomics, e os Institutos Canadenses de Pesquisa em Saúde de bolsas para JG e AG AE é um receptor de Vanier de Bolsas de Pós-Graduação no Canadá.

....

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
I. Antibióticos
Chloranfenicol	Bioshop	#CLR201
Canamicina		#KAN201
Ampicilina		# AMP201
2. Luria-Bertani médio
LB pó	Bioshop	#LBL405
Agar	Bioshop	#AGR003
3. Cepas bacterianas e plasmídeos
Hfr Cepa Cavalli λ red (JL238)	Babu et al.¹⁴.
pKD3	E. coli Centro de Estoque Genético, Yale
Keio E. coli Coleção de destinatários F	Projeto Nacional de BioRecursos (NBRP) do Japão¹¹
Cepas hipomórficas E. coli F- Cepas de tag SPA	Biossistemas abertos; Babu et al.¹⁴
4. Primers
pKD3-based primers			F1: 5'-GGCTGACATGGGAATTAGC-3' R1: 5'-AGATTGCAGCATTACACGTCTT-3'Primers
personalizados dessalgados			Cm-R: 5'-TTATACGCAAGGCGACAAGG-3' Cm-F: 5'- GATCTTCCGTCACAGGTAGG-3'Primers
personalizados dessalgados			F2 e R2: regiões constantes de 20 nt com base na sequência pKD3 e regiões de homologia personalizadas de 45 nt região constante F2: 5'-CATATGAATATCCTCCTTA-3' região constante R2: 5'-TGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC-3'S1 e S2: regiões constantes de 27 nt para preparar a amplificação do SPA-Cm e regiões de homologia personalizadas de 45 nt região constante S1: 5'AGCTGGAGGATCCATGGAAAAGAGAAG -3' região constante S2: 5'- GGCCCCATATGAATATCCTCCTTAGTT -3' KOCO-F e KOCO-C: 20 nts primers a 200 pb do local de deleção do gene não essencial ou do local de inserção da tag SPA-tag do gene essencial
5. Reagentes de PCR e Eletroforese< / strong >
Taq DNA polimerase	Fermentas	# EP0281
10X PCR buffer	Fermentas	# EP0281
10 mM dNTPs	Fermentas	# EP0281
25 mM MgCl < sub > 2< / sub>	Fermentas	# EP0281
Agarose	Bioshop	# AGA002
Carregando corante	NEB	#B7021S
Brometo de etídio	Bioshop	# ETB444
10X TBE buffer	Bioshop	# ETB444.10
Tris Base	Bioshop	# TRS001
Ácido bórico	Sigma	# T1503-1KG
0,5 M EDTA (pH 8,0)	Sigma	# B6768-500G
escada de DNA	NEB	#N3232L
6. Kits de isolamento e limpeza de DNA
Kit de isolamento e purificação de DNA genômico	Promega	#A1120
Kit Midi de plasmídeo	Qiagen	# 12143
QIAquick Kit de purificação de PCR	Qiagen	#28104
7. Equipamento para PCR, Transformação e Replica-pinning
Termociclador	BioRad, iCycler
Eletroforese em gel de agarose	BioRad
Electroporator	Bio-Rad GenePulser II
0,2 cm cubeta de eletroporação	Bio-Rad
42 ° Agitador em banho-maria C	Innova 3100
Centrífuga Beckman Coulter TJ-25	Beckman Coulter
32 ° C shaker	New Brunswick Scientific, EUA
32 ° Incubadora de placa C	Fisher Scientific
RoToR-HDA robô de bancada	Singer Instruments
96, 384 e 1.536 almofadas de densidade de pinos	Singer Instruments
96 ou 384 pinos longos	Singer Instruments
8. Equipamentos de Imagem
Suporte de câmera	Kaiser
Câmera digital, 10 megapixel	Qualquer fornecedor
Caixas de luz, unidades Testrite 16" x 24" Testrite
9. Almofadas ou Placas Reciclagem
10% alvejante	Qualquer Fornecedor
70% etanol	Qualquer Fornecedor
Água destilada estéril	Qualquer Fornecedor
Capuz de fluxo	Qualquer Fornecedor
Lâmpada ultravioleta	Qualquer Fornecedor
10. Material de laboratório
tubos de polipropileno de 50 ml	Any Vendor
Tubos de microcentrífuga de 1,5 ml	Any Vendor
Flaks cónicos de 250 ml	VWR	# 29140-045
Tubos de cultura estéreis de 15 ml	Frascos	# 366052
VWR	# 479-3221
Placas retangulares	poços da Singer Instruments
	Nunc		Singer
Instruments para vedação de placas		Sigma#R1275
	ABgene	# AB-0580
Vedações de placas adesivas	Fisher Scientific	# 13-990-14-80
° C freezer	Qualquer fornecedor

constantes dessalinizados criogénicos Thermo Scientific Placas de microtitulação de 96 e 384 Rolo de placa da multi-poços

Referências

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bandyopadhyay, S., Kelley, R., Krogan, N. J., Ideker, T. Functional maps of protein complexes from quantitative genetic interaction data. PLoS Comput. Biol. 4, e1000065(2008).
Costanzo, M., Baryshnikova, A., Myers, C. L., Andrews, B., Boone, C. Charting the genetic interaction....

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Synthetic Genetic Array Escherichia Coli Genetic Interaction Screening Colony Array Format Double Mutant Analysis Automated Image Processing Chloramphenicol Selection Kanamycin Selection Homologous Recombination Fitness Quantification

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