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Artigo de método

A coloração imuno-histoquímica de B7-H1 (PD-L1) na histológicos em parafina lâminas de tecido adenocarcinoma do pâncreas

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DOI:

10.3791/4059

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3 de janeiro de 2013

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1The Sidney Kimmel Comprehensive Cancer Center, The Johns Hopkins University School of Medicine, 2Department of Oncology, The Johns Hopkins University School of Medicine, 3Department of Dermatology, The Johns Hopkins University School of Medicine, 4Department of Surgery, Johns Hopkins University School of Medicine, 5The Sol Goldman Pancreatic Cancer Center, The Johns Hopkins University School of Medicine, 6Yale Cancer Center, Yale School of Medicine, 7The Skip Viragh Center for Pancreatic Cancer, The Johns Hopkins University School of Medicine, 8Department of Pathology, The Johns Hopkins University School of Medicine

Neste artigo

Resumo

B7-H1 (PD-L1) e a sua ligação ao PD-1 fornece um sinal induzida por tumor principal imunossupressor no microambiente do tumor. Uma técnica de coloração imuno-histoquímica para caracterizar a expressão e localização de B7-H1 em adenocarcinoma pancreático é descrito aqui.

Resumo

B7-H1/PD-L1, um membro da família B7 de imuno-regulação de superfície celular de proteínas, tem um papel importante na regulação negativa de respostas mediadas por células imunitárias através da sua interacção com o seu receptor, a morte programada-1 (DP -1) 1,2. A sobre-expressão de B7-H1 por células tumorais foi observado em vários cancros humanos, incluindo o melanoma, glioblastoma, e carcinomas do pulmão, mama, cólon, ovário e células renais, e tem sido mostrado para danificar anti-tumorais T- imunidade celular 3-8.

Recentemente, a expressão B7-H1 por tecidos de adenocarcinoma do pâncreas foi identificado como um potencial marcador de prognóstico 9,10. Além disso, o bloqueio de B7-H1, em um modelo de rato de cancro pancreático foi mostrado para produzir uma resposta anti-tumor 11. Estes dados sugerem a importância de B7-H1 como um potencial alvo terapêutico. Anticorpos anti-B7-H1 bloqueio são, portanto, está sendo testado em ensaios clínicos para multiple tumores sólidos humanos, incluindo melanoma e cancros do pulmão, do cólon, estômago, rim e pâncreas 12.

A fim de, eventualmente, ser capaz de identificar os doentes que irão beneficiar de B7-H1 terapias com alvo, é crítico para investigar a correlação entre a expressão e localização de B7-H1 e a resposta do paciente ao tratamento com os anticorpos B7-H1 bloqueio. Examinando a expressão de B7-H1 em tecidos pancreáticos humanos através de adenocarcinoma imunohistoquímica dará um melhor entendimento de como esta molécula de sinalização co-inibidor contribui para a supressão da imunidade antitumoral em microambiente do tumor. O anticorpo anti-B7-H1 monoclonal (clone 5H1), desenvolvido por Chen e colaboradores demonstrou produzir resultados fiáveis ​​em criocortes de coloração de vários tipos de tecidos neoplásicos humanos 4,8, mas a coloração de lâminas embebidas em parafina tinha sido um desafio até Recentemente, 13-18. Temos devfugiu do protocolo de coloração B7-H1 para os slides incluídos em parafina de tecidos de adenocarcinoma do pâncreas. O protocolo de coloração B7-H1 descrito aqui produz a coloração das membranas e citoplasmática consistente de B7-H1 com pouco fundo.

Protocolo

B7-H1/PD-L1, um membro da família B7 de imuno-regulação de superfície celular de proteínas, tem um papel importante na regulação negativa de respostas mediadas por células imunitárias através da sua interacção com o seu receptor, a morte programada-1 (DP -1) 1,2. A sobre-expressão de B7-H1 por células tumorais foi observado em vários cancros humanos, incluindo o melanoma, glioblastoma, e carcinomas do pulmão, mama, cólon, ovário e células renais, e tem sido mostrado para danificar anti-tumorais T- imunidade celular 3-8.

Recentemente, a expressão B7-H1 por tecidos de adenocarcinoma do pâncreas foi identificado como um potencial marcador de prognóstico 9,10. Além disso, o bloqueio de B7-H1, em um modelo de rato de cancro pancreático foi mostrado para produzir uma resposta anti-tumor 11. Estes dados sugerem a importância de B7-H1 como um potencial alvo terapêutico. Anticorpos anti-B7-H1 bloqueio são, portanto, está sendo testado em ensaios clínicos para humana múltiplatumores sólidos, incluindo melanoma e cancros do pulmão, do cólon, estômago, rim e pâncreas 12.

A fim de, eventualmente, ser capaz de identificar os doentes que irão beneficiar de B7-H1 terapias com alvo, é crítico para investigar a correlação entre a expressão e localização de B7-H1 e a resposta do paciente ao tratamento com os anticorpos B7-H1 bloqueio. Examinando a expressão de B7-H1 em tecidos pancreáticos humanos através de adenocarcinoma imunohistoquímica dará um melhor entendimento de como esta molécula de sinalização co-inibidor contribui para a supressão da imunidade antitumoral em microambiente do tumor. O anticorpo anti-B7-H1 monoclonal (clone 5H1), desenvolvido por Chen e colaboradores demonstrou produzir resultados fiáveis ​​em criocortes de coloração de vários tipos de tecidos neoplásicos humanos 4,8, mas a coloração de lâminas embebidas em parafina tinha sido um desafio até Recentemente, 13-18. Nós desenvolvemos o staini B7-H1ng protocolo para slides incluídos em parafina de tecidos de adenocarcinoma do pâncreas. O protocolo de coloração B7-H1 descrito aqui produz a coloração das membranas e citoplasmática consistente de B7-H1 com pouco fundo.

1. De-parafinization

  1. Asse desliza a 55 ° C durante 20 min.
  2. Em um capuz químico, mergulhe slides em xileno por 10 min.
  3. Imergir as lâminas em xileno fresco por 10 min.
  4. Imergir desliza em etanol a 100% durante 5 min.
  5. Imergir desliza em etanol a 100% fresco durante 5 min.
  6. Imergir desliza em etanol a 95% durante 5 min.
  7. Imergir desliza em etanol a 80% durante 5 min.
  8. Imergir desliza em água desionizada durante 5 min.

2. A recuperação antigênica

  1. Imergir as lâminas em tampão Tris-EDTA (pH 9,0) e de calor em uma panela de pressão a 125 ° C durante 30 seg, depois 90 ° C durante 10 seg.
  2. Deixe esfriar por lâminas de 60 min.
  3. Imergir as lâminas em TBST por 5 min; REPEmenos duas vezes.

3. Coloração

  1. Limpe soluções em volta do tecido nos slides. Marcar um círculo em torno do tecido com uma caneta hidrofóbica.
  2. Colocar as lâminas numa câmara de humidade e evitar a secagem do tecido na lâmina durante o processo de coloração inteiro. Colocar uma gota (aproximadamente 200 uL ou superior para cobrir a área do tecido completamente) de bloqueio da peroxidase no círculo hidrofóbico sobre a lâmina e incubar no bloqueio da peroxidase, durante 5 min.
  3. Lavar as lâminas com TBST, e depois colocar em TBST durante 5 minutos.
  4. Depositar uma gota de um tampão de bloqueio BLOCK ACE em cada lâmina e incubar durante 15 min.
  5. Lavar as lâminas com TBST, e depois colocar em TBST durante 5 minutos.
  6. Colocar uma gota de solução de Avidina em cada lâmina e incubar durante 15 min.
  7. Lavar as lâminas com TBST, e depois colocar em TBST durante 5 minutos.
  8. Colocar uma gota de solução de biotina em cada lâmina e incubar durante 15 min.
  9. Lavar slides com TBST, e depois colocar em TBST durante 5 minutos.
  10. Incubar as lâminas com a diluição de 1:1000 de anticorpo de ratinho anti-B7-H1 monoclonal (clone 5H1) ou de um rato de controlo de isotipo IgG1 κ em 200 ul de TBST, a 4 ° C durante a noite, durante 22 h + / - 1 h. A concentração de anticorpo final em TBST é 2,57 ng / ml.
  11. Lavar as lâminas com TBST, e depois colocar em TBST durante 5 minutos. Repita duas vezes.
  12. Incubar as lâminas com um conjugado de biotina anti-ratinho de rato-IgG1 anticorpo secundário, a uma concentração de 1:500 (em 200 ul de solução de cabra 2% de soro) durante 30 minutos.
  13. Lavar as lâminas com TBST, e depois colocar em TBST durante 5 minutos. Repita duas vezes.
  14. Depositar uma gota de um complexo de estreptavidina-biotina (deve ser preparada, pelo menos, 30 min antes da sua utilização) em cada lâmina e incubar durante 15 min.
  15. Lavar as lâminas com TBST, e depois colocar em TBST durante 5 minutos. Repita duas vezes.
  16. Colocar uma gota de Reagente de Amplificação (diluído 2:1 com TBST) em cada lâmina e incubar durante 4 min.
  17. Lavar as lâminas com TBST, e depois colocar em TBST durante 5 minutos. Repita duas vezes.
  18. Colocar uma gota de Estreptavidina-HRP em cada lâmina e incubar durante 15 min.
  19. Lavar as lâminas com TBST, e depois colocar em TBST durante 5 minutos. Repita duas vezes.
  20. Colocar uma gota de 3,3-diaminobenzidina (DAB) e substrato cromogénio em cada lâmina e desenvolver a cor durante 2 min.
  21. Imediatamente após o desenvolvimento de cor, lavagem das lâminas com DDQ 2 O durante 1-2 min.
  22. Incubar as lâminas com uma gota de hematoxilina durante 90 segundos.
  23. Lava-se com DDQ 2 O durante 1-2 min.
  24. Lavar com água corrente e sabão por 1-2 min.
  25. Lava-se com DDQ 2 O durante 1-2 min.

4. Desidratação e montagem

  1. Imergir as lâminas em etanol a 80% durante 3 min.
  2. Imergir as lâminas em etanol a 95% durante 3 min.
  3. Imergir as lâminas em etanol a 100% durante 5 min. Repetir.
  4. Mergulhe as lâminas em xilol por 5 min. Repetir.
  5. Adicione uma gota deCytoseal 60 para o slide e colocar a lamela.

A Tabela 1 enumera os reagentes utilizados nos procedimentos acima descritos.

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Resultados

A coloração imuno-histoquímica de sucesso de B7-H1 irá demonstrar a expressão heterogénea de B7-H1 (castanho sinais de desenvolvimento de cor DAB) em adenocarcinoma pancreático. Algumas células de adenocarcinoma do pâncreas têm uma expressão predominantemente membranosas de B7-H1 (Figura 1A) enquanto que outros têm uma expressão ou predominantemente citoplasmática de B7-H1 ou pouca expressão de B7-H1 (Figura 2 e 3). Epitélio pancreático normal duto expressa pouco B7-H1 (Figura 4...

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Discussão

A coloração imuno-histoquímica de B7-H1 em criocortes tem sido relatada em estudos anteriores para uma variedade de cancros 3,4. No entanto, as amostras de tumor clínicos geralmente só estão disponíveis sob a forma de blocos embebidos em parafina. O anticorpo monoclonal 5H1 mais recentemente tem sido aplicado com sucesso para a coloração de tecidos embebidos em parafina de tumores, incluindo carcinoma de células renais, carcinoma cervical, cancro da bexiga e melanoma 13-18. B7-H1 coloração em paraf...

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Divulgações

Não há conflitos de interesse declarados.

Agradecimentos

EB, KMB, e HX contribuir igualmente. Este estudo foi financiado pelo NCI SPORE em Cânceres Gastrointestinais P50 CA062924, CA148964 NIH K23, Lustgarten Foundation, Viragh Foundation, ASCO Young Investigator Award, NIH 5T32 CA0090701-28 Formação Grant, Sol Goldman Centro de cancro do pâncreas, e da Fundação Nacional de Pâncreas.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Nome do reagente Companhia Número de catálogo Comentários
CSA Sistema Dako K1500 Inclui os seguintes reagentes mencionados no protocolo: bloqueio da peroxidase, estreptavidina-biotina complexos, reagentes de amplificação, estreptavidina-HRP e DAB substrato eo cromógeno
Avidina / biotina Blocking Kit Vetor SP-2001
Bloco ACE Serotec BUF029
Biotina anti-mouse IgG1 BD 553441
IgG1 de ratinho de controlo K Isotype eBioscience 14-4714-85
TBS (Tris-solução salina tamponada), 10X Cellgro 46-012 CM- 10xTBS contém 80 g / L de NaCl e 24,2 g / L Tirs;
Diluído a 1X com ddH2O para lavagens;
Tween 20 Sigma-Aldrich P1379 Adicionado 1 ml para 1 L de 1X TBS para fazer TBST
Alvo de recuperação, 20x Celerus Onda 014-3000-000 Diluída para 1x com DDH 2 O
190 Prova Álcool Etílico Pharmco-Aaper 111000190
200 Prova Álcool Etílico Pharmo-Aaper 111000200
Xileno VWR 95057-827
Hematoxilina Richard-Allan Scientific 72804
Cytoseal 60 Richard-Allan Scientific 8310-4
Lamelas Corning 2940-245
Câmara de umidade Sigma H6644
Tabela 1. Reagentes e equipamentos.

Referências

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