Artigo de método
Microglia residem macrófagos que fornecem a primeira linha de defesa e vigilância imune do sistema nervoso central. MicroRNAs são moléculas reguladoras, que desempenham um papel importante em muitos processos fisiológicos, incluindo a activação e diferenciação dos macrófagos. Neste artigo, descrevemos o método para a medição de microRNAs em microglia.
Microglia são células da linhagem mielóide que residem no sistema nervoso central (CNS) 1. Estas células desempenham um papel importante na patologia de muitas doenças associadas com neuroinflamação tais como a esclerose múltipla (MS) 2. Microglia em um CNS normais expressar macrófagos CD11b marcador e exibem um fenótipo de repouso por expressar níveis baixos de marcadores de activação, tais como CD45. Durante os eventos patológicos no SNC, a microglia tornar-se activado, tal como determinado por supra-regulação de CD45 e outros marcadores 3. Os fatores que afetam microglia fenótipo e funções no sistema nervoso central não são bem estudadas. MicroRNAs (miRNAs) são uma família em crescimento de moléculas conservada (~ 22 nucleótidos de comprimento) que estão envolvidas em muitos processos fisiológicos normais tais como o crescimento e diferenciação celular 4 e patologias tais como a inflamação 5. MiRNAs regular negativamente a expressão de genes alvo determinados por ligação sequências complementares doIR mRNAs e desempenham um papel importante na activação de células imunes inatas incluindo macrófagos 6 e 7 microglia. A fim de investigar miRNA vias mediadas que definem o fenótipo microglial função biológica, e para distinguir microglia de outros tipos de macrófagos, é importante para avaliar quantitativamente a expressão de microRNAs particulares em subconjuntos distintos de CNS residente microglia. Os métodos comuns para medir a expressão de miRNAs no SNC incluem PCR quantitativo a partir de tecido neuronal geral e hibridação in situ. No entanto, PCR quantitativo a partir de homogeneizado de tecido inteiro não permite a avaliação da expressão de miRNA em microglia, que representam apenas 5-15% das células de tecido neuronal. A hibridação in situ permite a avaliação da expressão de microRNA em tipos de células específicos nas secções de tecido, mas este método não é inteiramente quantitativa. Neste relatório nós descrevemos um quantitativo e senstivo método para a detecção de miRNA por PCR em tempo real em microglia isolado a partir de CNS normais ou durante neuroinflamação utilizando encefalomielite autoimune experimental (EAE), um modelo de ratinho para a MS. O método descrito irá ser útil para medir o nível de expressão de microRNAs em microglia no SNC normais ou durante neuroinflamação associado com várias patologias, incluindo esclerose múltipla, lesão, acidente vascular cerebral traumática, doença de Alzheimer e tumores cerebrais.
1. Isolamento da microglia do CNS normais
Isolamento de microglia é realizado como foi descrito anteriormente com modificações 3.
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Recentemente interesse significativo foi dado a microglia e envolvimento destas células em muitas patologias associadas com neuroinflamação e neurodegeneração. Além disso, o papel de microRNAs na diferenciação de células imunes e cancro dramaticamente aumentado ao longo dos últimos 5,10 vários anos. Nós previamente relatado o papel de miR-124 na manutenção do fenótipo não-activado ou de repouso da microglia no CNS normais 7, mas o papel dos outros tipos de microRNAs em microglia fenótipo e estado d.......
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Não há conflitos de interesse declarados.
O trabalho foi suportado pelo NIH R01 NS071039-01A1 bolsa de investigação.
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| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Nome do reagente | Companhia | Número de catálogo | Comentários |
| 1X PBS | GIBCO | 14190 | Pode ser preparado a partir de componentes secos em laboratório, pH: 7,2-7,4 |
| PBS 10X | Thermo Scientific | SH30258.02 | Pode ser preparado a partir de componentes secos em laboratório, pH: 7,2-7,4 |
| DMEM; FBS | GBCO | 11965; 10438 | |
| Mirvana kit | Invitrogen | AM1561 | |
| Percoll | Sigma | P4937-500 ml | 100 ml de Percoll 100% é preparada misturando 10 ml de PBS 10X e 90 ml de Percoll a partir de Sigma. 50 ml de Percoll 70% épreparada por mistura de 35 ml de Percoll 100% e 15 ml de DMEM 50 ml de Percoll 40% é preparada por mistura de 20 ml de Percoll 100% e 30 ml de PBS 1X |
| MOG 35-55 peptídeo | AnaSpec Inc | 60130-5 | |
| CFA | DIFCO | 263810 | |
| Toxina Pertussis | Sigma | P7208 | |
| FcR anticorpos bloqueadores | BD Biosciences | 553142 | Clone 2.4G2 |
| Anti-CD11b - PE mAb | BD Biosciences | 553311 | Pode ser usado com fluoróforos diferentes (por exemplo AF488) |
| Anti-CD45-APC-Cy7 mAbs | Biolegend | 103116 | Pode ser usado com fluoróforos diferentes (por exemplo APC) |
| Paraformaldehyde (16%) | EMS Inc | 15710 | Diluir 1:15 em PBS 1X |
| 15% Gel TBE-uréia | Life Technologies Inc. | EC68855BOX | |
| MicroRNA TaqMan Kit Transcrição Reversa | Life Technologies Inc | 4366596 | |
| TaqMan Universal PCR Master Mix | Life Technologies Inc | 4304437 | |
| Ensaios TaqMan mmu microRNA-miR-124a | Life Technologies Inc | 4427975 ID 001182 | |
| Ensaios de microRNA TaqMan snoRNA-55 | Life Technologies Inc | 4427975 ID 001228 | |
| Livre de nuclease água | Life Technologies Inc | AM9937 | Livre de nuclease água |
| 384-placa de reação bem claro óptica | Life Technologies Inc. | 4309849 | Pode ser substituído com outras placas (por exemplo, placa de 96 poços) em diferentes instrumentos de PCR em tempo real |
| Dounce homogeneizador (15 ml) | Produtos Wheaton Ciência. | 358044 | Teflon / vidro |
| 40 μ filtro célula nylon | Falcão | 352340 | |
| Big centrífuga | Sorval | RT 6000B | Rotor diâmetro 18,5 centímetros |
| Centrífuga Pequeno | Eppendorf | 5415 R | Rotor diâmetro 6,5 centímetros |
| Real-time PCR Instrumento | Life Technologies Inc. | AB 7900 HT | Pode ser substituído com outros instrumentos |
| Citômetro de fluxo | BD Biosciencess | LSR II | Pode ser substituído com outros instrumentos |
| FACS | BD Biosciences | FACSAria | Pode ser substituído com outros instrumentos |
| Espectrofotômetro Nanodrop | Thermo Scientific | Nanodrop 1000 |
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