Uma avaliação quantitativa da migração celular pelo ensaio Phagokinetic faixa Motilidade

Resumo

O ensaio de pista phagokinetic motilidade é um método utilizado para avaliar o movimento das células. Especificamente, o ensaio mede quimiocinese (motilidade celular aleatória) ao longo do tempo de uma forma quantitativa. O ensaio tira vantagem da capacidade das células para criar uma faixa mensurável do seu movimento em coloidais de ouro revestidas com lamelas.

Resumo

Motilidade celular é um processo biológico importante para ambos os organismos unicelulares e multicelulares. É essencial para o movimento de organismos unicelulares para uma fonte de nutrientes ou de distância a partir de condições inadequadas, bem como em organismos multicelulares para o desenvolvimento do tecido, a vigilância imunitária e cicatrização de feridas, apenas para mencionar alguns papéis ^1,2,3. Desregulação deste processo pode conduzir a graves doenças neurológicas, cardiovasculares e imunológicas, assim como a formação de tumores e exacerbada espalhar ^4,5. Molecularmente, actina de polimerização e reciclagem do receptor têm sido mostrados para desempenhar um papel importante na criação de extensões celulares (lamellipodia), que orientam o movimento para a frente da célula ^6,7,8. No entanto, muitas questões biológicas sobre a migração de células permanecem sem resposta.

O papel central para a motilidade celular na saúde humana e doenças sublinha a importância de compreender o mec específicahanisms envolvidos neste processo e torna os métodos precisos para avaliar a motilidade celular particularmente importante. Microscópios são geralmente usados ​​para visualizar o movimento das células. No entanto, as células se movem muito lentamente, fazendo a medição quantitativa da migração de células de um processo que consome recursos exigindo câmeras caras e software para criar quantitativos tempo decorrido filmes de células móveis. Portanto, a capacidade para realizar uma medição quantitativa da migração de células que é de custo eficaz, não-trabalhoso, e que utiliza equipamento de laboratório comum é uma grande necessidade de muitos investigadores.

O ensaio de motilidade phagokinetic faixa utiliza a capacidade de uma célula que se deslocam para limpar as partículas de ouro a partir do seu caminho para a criação de uma faixa mensurável sobre uma lamela de vidro revestido a ouro coloidal ^9,10. Com o uso de software disponível livremente, várias faixas podem ser avaliados para cada tratamento para realizar requisitos estatísticos. O ensaio pode ser utilizado para avaliarmotilidade de muitos tipos de células, tais como células cancerosas, ^11,12, fibroblastos, neutrófilos ^{9 13,} células do músculo esquelético, queratinócitos ^{14 15, 16} trofoblastos, células endoteliais e monócitos, ^{17 10,18-22.} O protocolo envolve a criação de lâminas revestidas com nanopartículas de ouro (Au °) que são gerados por uma redução de ácido cloroáurico (Au ^{3 +)} por citrato de sódio. Este método foi desenvolvido por Turkevich et al. Em 1951 ²³ e, em seguida, melhorado na década de 1970 por Frens et al. ^24,25. Como um resultado deste passo de redução química, as partículas de ouro (10-20 nm de diâmetro) precipitar a partir da mistura de reacção e pode ser aplicado a lamelas de vidro, os quais são, então, pronto para utilização em análises de migração celular ^9,26,27.

Em geral, o ensaio de motilidade phagokinetic pista é uma medida rápida, fácil e quantitativo da motilidade celular. Além disso, elepode ser utilizado como um ensaio de elevado débito simples, para ser utilizado com os tipos de células que não são passíveis de tempo caduco de imagem, assim como outras utilizações, dependendo das necessidades do investigador. Em conjunto, a capacidade de medir quantitativamente a motilidade celular de vários tipos de células, sem a necessidade de caros microscópios e software, bem como o uso de equipamento de laboratório comuns e produtos químicos, fazer o ensaio de motilidade phagokinetic faixa uma escolha sólida para cientistas com interesse na compreensão celular motilidade.

Protocolo

1. Preparação de gelatina revestidos Lamelas

1. Colocar o ácido-lavadas lamelas de vidro (15 mm de diâmetro) numa placa de plástico estéril milímetro 100 (ES). Coloque 8-9 lamínulas por placa e verifique se eles não estão tocando um ao outro ou os lados do prato ..

Nota: As lamelas, agulhas e pinças devem ser estéreis para eliminar possíveis microorganismos contaminantes, assim como endotoxinas, que irão afectar as funções celulares, incluindo a motilidade.

2. Pesa-se o pó de gelatina e ressuspender o pó em água desionizada para produzir uma solução de gelatina com uma concentração final ....

Resultados

É mostrado um exemplo de imagens tomadas com um microscópio de luz, mostrando a área eliminada por via de uma única célula (a partir de monócitos nossas experiências é mostrado na Figura 2). As células não-móveis criar característica oval, pequeno ou em forma de círculo em torno de si tractos indicando um baixo nível basal de movimento para estas células não estimuladas (figuras 2A e 2B). Em contraste, as células altamente motile [no nosso sistema, o citomegalovírus humano (HCMV), as cé.......

Discussão

O ensaio de motilidade phagokinetic faixa apresentada neste artigo é um método simples e altamente eficaz para a análise quantitativa da migração celular. Porque vários tipos de células pode ser analisada ^9-17, este método tem o potencial de uso amplo em várias disciplinas. A utilização de lamelas de ouro coloidal revestido de vidro permite a medição de uma área de faixa, compensado por uma célula em movimento. O ensaio pode medir o efeito de diferentes estímulos (por exemplo, factores de crescimento.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Nome do reagente	Companhia	Número de catálogo	Comentários
Lamelas de vidro (15 mm)	Fisher Scientific	12-545-83
Gelatina Bloom 300	Sigma-Aldrich	G-1890
Trihydrate Ácido tetracloroáurico	Fisher Chemical	G54-1	14,5 mM (uma solução de trabalho final)
Citrato de sódio	Fisher Scientific	BP327-500	0,5% (solução de trabalho final)
Paraformaldeído	Fisher Scientific	O4042	3% (de uma solução de trabalho final)
100 placas de cultura de tecidos milímetros	Sarstedt	83,1802
Placas de 12 poços	Fisher Scientific	08-772-29
Placas de 24 poços	Fisher Scientific	07-200-84
Forno Techne Hybridiser HB-1D	LabPlanet	2040500	O forno de laboratório padrão será suficiente
10 ml Pipetas sorológicas	Sarstedt	86.1254.001
Pipeta-Aid Filler / Dispenser	Drummond	13-681-15
P200 Single-Channel manual pipeta	Rainin	PR-200
200 ml de barreira Dicas	CLP	BT200
ImageJ software	http :/ / rsb.info.nih.gov / ij /		Licença: Domínio Público
Nikon Eclipse TE300 com um CoolSNAPfx Fotometria monocromático 12-bit câmera CCD	Nikon		Descontinuado; A especificação mais comparável tem Nikon Eclipse Ti, mas uma extremidade inferior Nikon 80i será apropriado também. Outras marcas também fornecer microscópios comparáveis.
			Nota: Os reagentes e equipamentos listados abaixo foram utilizados por nós em nossos vários estudos. Outras fontes, de fornecedores, reagentes e equipamentos que podem ser usados, contanto que elas têm especificações semelhantes.